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Wolbachia(沃尔巴克氏体)是一类呈母性遗传的细胞内共生菌,这类细菌能够引发宿主的多种生殖异常行为,如:①胞质不融和现象(cytoplasmic incompatibility,CI),即在同一物种里,感染Wolbachia的雄虫与未感染Wolbachia的雌虫交配或感染不同株系Wolbachia的雌雄个体交配,往往产生不亲和现象；②孤雌生殖(parthenogenesis),如在膜翅目寄生蜂里发现感染Wolbachia的雌虫的未受精卵发育为雌虫；③雌性化(feminization),如在玉米螟和某些陆生等足类甲壳纲动物中,Wolbachia改变宿主正常的性别决定机制,让本该发育为雄虫的个体发育成雌虫；④杀雄(male-killing),如在非洲的一种斑蛱蝶Acraea endedon和二星瓢虫Adalia bipunctata中,由于Wolbachia的作用,雄虫在发育过程中死亡。
同Wolbachia一样,Cardinium也是通过母体遗传的内寄生微生物。因为长期以来,Wolbachia一直被认为是唯一能够对寄主生殖作用产生各种影响的寄生微生物。自从Cardinium被发现以来,这几年的研究已经证实它能引起由Wolbachia对寄主生殖产生的四种操控作用中的三种(细胞质不融合、雌性化和孤雌生殖)。这些能够进行生殖操控的寄生菌将为害虫的生物防治提供一条崭新的途径,并且有可能在多种虫媒传播的动植物疾病的防治上应用。
本文利用分子生物学方法,通过实时定量PCR测定叶螨体内感染的Wolbachia和Cardinium的密度,总结出了这两种共生菌在朱砂叶螨和二斑叶螨生长发育过程中的密度变化,可以推测出共生菌的密度和寄主的生殖存在一定的关系。我们还比较了Wolbachia在朱砂叶螨和二斑叶螨中密度的差异,发现Wolibachia在二斑叶螨中的密度要明显高于其在朱砂叶螨中的密度。另外,我们还从同时感染这两种共生菌的种群入手,比较Wolbachia和Cardinium在同一个虫体内密度的差异,发现Cardinium在共存时的密度要高于其单独存在时的密度,也高于共存的Wolbachia的密度。如果寄主体内的这两种共生菌存在某种竞争机制,我们可以推测Cardinium在竞争中更占优势。
一、试验材料的选择和饲养
在实验室饲养的种群中选择较有代表性朱砂叶螨和二斑叶螨,江苏镇江的朱砂叶螨,辽宁兴城和江苏徐州的二斑叶螨。实验室内采用隔水法在菜豆(Phaseolus vulgarisL.)叶片上进行恒温恒湿隔离饲养,饲养条件为25±1℃,L16:D8,相对湿度60％。
二、实时定量PCR测定朱砂叶螨个体不同发育时期的Wolbachia密度变化
根据序列号为DQ016532的wsp基因设计一对特异性引物检测江苏镇江地理种群的不同发育时期的单头虫体的Wolbachia密度的变化。在整个生长发育的过程中,叶螨体内的Wolbachia密度不断上升,对于相同发育阶段的朱砂叶螨,雌虫所含Wolbachia的密度明显高于雄虫,且单感染Wolbachia虫体的Wolbachia密度要高于同时感染Wolbachia和Cardinium的虫体的Wolbachia密度。
三、实时定量PCR测定朱砂叶螨个体不同发育时期的Cardinium密度变化
根据Cardinium共生菌的16S rDNA基因序列我们设计了一对特异性引物来定量检测Cardinium在江苏镇江地理种群朱砂叶螨个体内的密度。和Wolbachia相同的是,在整个生长发育的过程中,叶螨体内的Wolbachia密度不断上升,对于相同发育阶段的朱砂叶螨,雌虫体内Cardinium的密度明显高于雄虫；和Wolbachia不同的是,单感染Cardinium的虫体的Cardinium密度要低于同时感染Wolbachia和Cardinium的虫体的Cardinium密度。
四、实时定量PCR测定二斑叶螨个体不同发育时期的Wolbachia密度变化
使用设计好的一对特异性引物定量检测Wolbachia在二斑叶螨个体内的密度,在整个生长发育的过程中,叶螨体内的Wolbachia密度不断上升,对于相同发育时期的二斑叶螨,雌虫体内Wolbachia的密度明显高于雄虫,但是比较二斑叶螨两个地理种群中,相同发育时期单头叶螨体内共生菌的密度,结果并无明显差异。
对于相同发育时期个体,二斑叶螨体内Wolbachia的密度明显高于朱砂叶螨,甚至二斑叶螨雄虫体内Wolbachia的密度都高于单感染或者双感染朱砂叶螨的Wolbachia的密度,说明Wolbachia在二斑叶螨中有更高的适合度。
综上所述,本研究利用分子生物学技术,定量的检测了Wolbachia和Cardinium在朱砂叶螨和二斑叶螨个体体内的密度变化情况,总结出了一定的规律,比较了同种共生菌在不同叶螨中的密度差异,比较了在同一个体内不同共生菌的密度差异,这将为今后对Wolbachia和Cardinium的感染机制和生殖调控作用的深入研究奠定基础,为共生菌在生物防治上的应用提供科学依据。