子宫内膜癌是妇女最常见的生殖系统恶性肿瘤之一,按照病理组织学特点可分为子宫内膜样癌(Ⅰ型)和非子宫内膜样癌(Ⅱ型),其中,80-90%的病例属于子宫内膜样癌。子宫内膜癌好发于围绝经期妇女,合并肥胖、糖尿病、高血压、未曾生育者以及长期不排卵者皆是高危险族群,其中超过86%的病人年龄在50岁以上。随着高血压、冠心病、肥胖、糖尿病和代谢综合征等高危因素疾病发病率的提高以及人们饮食结构的渐行改变,该病发病率逐年增高且发病年龄年轻化。但子宫内膜癌发生的分子机制尚不清楚。早期发现和治疗是改善预后、提高治愈率的关键。深入研究子宫内膜癌相关基因的异常表达机制将有助于其早期诊断、预防及治疗,具有极其重要的意义。PTEN基因(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome10)位于10q23.3,是重要的抑癌基因,PTEN蛋白的缺失(又称为功能性失活)与子宫内膜样癌的发生和发展密切相关,小鼠纯合型PTEN基因的失活可直接并迅速地导致子宫内膜样癌的发病。目前认为PTEN抑癌作用主要与其蛋白酪氨酸磷酸酶和脂质磷酸酶的活性有关。研究显示,已知PTEN在PI3-K/Akt/PKB/cyclinD, GSK3β/βcatenin/cyclinD, FAK/MAPK PI3-K/Akt/mTOR/STAT3等通路中起重要抑制作用,能够促凋亡、抗增殖,而其缺失或突变则导致肿瘤的发生。然而,子宫内膜样癌中PTEN蛋白失活的机制尚不明确。据报道,子宫内膜样癌中PTEN蛋白的失活率为50-83%,而其PTEN基因的突变率仅为34-55%,单纯用突变机制不足以解释子宫内膜样癌中PTEN蛋白的失活。近年来,一种新的基因调控因子microRNAs的发现,为深入研究基因的调控及疾病的发生发展提供了新的思路。本论文试图从新的角度——microRNA方面探讨子宫内膜样癌中PTEN基因的调控机制。MicroRNAs是指18到25个核苷酸大小的非编码RNA分子,通过结合与之互补或部分互补的编码蛋白质的mRNA起到调节其表达的作用,包括抑制其转录或降解。这是一种新近发现的新层次的基因表达调控机制。MicroRNA就像是“分子变阻器”,精调着每个基因的蛋白合成。MicroRNAs在细胞生长和发育过程中起多种作用,能够与靶mRNAs3’端非编码区域(3’-UTR)相结合,使靶基因mRNA降解或沉默从而阻止其进一步的翻译表达。目前,MicroRNAs被认为是可能在肿瘤发生发展中起重要作用的因子。MicroRNAs作为一种可调控基因表达的内源性小分子,是体内重要的转录后调节因子,典型的microRNAs是靶向多个基因而不是单个基因,在体内形成重要的基因调控网络,参与调节肿瘤的发生和细胞恶性生物学行为改变。MicroRNA-21(miR-21)作为最早被发现的microRNAs分子之一,已经被证实在多种肿瘤组织中异常表达(多为实体肿瘤),如结肠直肠癌、胆管癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈部癌、脑胶质瘤、肺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫肌瘤等。MiR-21的异常表达可以影响肿瘤的增殖、凋亡、血管浸润及淋巴结转移等恶性生物学行为。Meng F等在人肝癌细胞中的研究表明,miR-21可以通过调节PTEN表达起到促进癌细胞增殖、迁移、浸润的作用,PTEN是miR-21的直接靶基因之一。迄今为止,尚无有关miR-21在子宫内膜癌中表达的研究报道。据有关研究显示,在子宫内膜异位症在位内膜和异位内膜中差异表达的miRNAs分子中包括hsa-miR-21,并且证明了miRNAs的异常表达受雌孕激素的影响,其通过作用于靶基因,在正常子宫内膜活性和子宫内膜异位症发病机制中起核心性作用。这说明miR-21在子宫内膜中亦有表达,而且其靶基因在内膜细胞活性和病理生理方面起重要的作用。本研究旨在揭示子宫内膜样癌中miR-21的表达情况,研究其对PTEN基因的调控机制及对肿瘤细胞生物学行为的影响。[研究目的]1.检测并分析miR-21在子宫内膜样癌癌灶与相应癌旁组织中是否存在差异表达。2.分析miR-21的表达与子宫内膜样癌组织的临床病理特征如临床分期、病理分级、淋巴结转移以及肌层浸润之间的关系。3.检测子宫内膜样癌组织中PTEN蛋白水平的表达,并分析其与miR-21的表达是否具有相关性。[研究方法]1.收集新鲜未经任何干预治疗的子宫内膜样癌组织及相应癌旁组织标本。2.应用茎环引物实时荧光定量逆转录聚合酶链(RT-PCR)反应的方法检测子宫内膜样癌组织及相应癌旁组织标本中miR-21的表达。3.采用蛋白免疫印记(Western Blot)方法,检测PTEN蛋白在子宫内膜样癌癌灶及相应癌旁组织标本中的表达。[结果]1.MiR-21在所检测子宫内膜样癌癌灶及相应癌旁组织中均有表达,其在肿瘤组织中的表达约为癌旁组织的2.879倍(范围1.021-7.402,标准差为1.625,P<0.05)。2.MiR-21在各临床分期的子宫内膜样癌肿瘤组织中相对表达量分别为：Ⅰ期2.178±1.158,Ⅱ、Ⅲ期3.510±1.749,miR-21在Ⅱ+Ⅲ期较Ⅰ期内膜样腺癌组织中相对表达量明显升高(P=0.01)；miR-21在肌层浸润深度大于1/2肌层组中肿瘤组织的相对表达量为3.972±1.797,明显高于其在肌层浸润深度小于1/2肌层组的相对表达量2.084±0.881(P=0.001)；miR-21在G1、G2及G3期子宫内膜癌肿瘤组织中的相对表达量分别为：1.376±0.229,2.452±0.447及5.002±1.299,G3较G2及G2较G1期内膜样腺癌肿瘤组织中miR-21相对表达量均明显升高(P<0.01)。3.Western Blot分析结果表明,子宫内膜样癌组织PTEN蛋白的相对表达量明显低于相应癌旁组织(P<0.05)。4.Pearson相关分析结果表明,子宫内膜样癌肿瘤组织中miR-21的相对表达量与PTEN蛋白的相对表达量显著负相关(Pearson correlation=—0.762,P<0.001)。[结论]MiR-21在子宫内膜样癌肿瘤组织较相应癌旁组织表达增高,其相对表达量与肿瘤组织的临床分期、病理分级及肌层浸润深度呈正相关,提示miR-21可能在子宫内膜样癌的发生发展过程中发挥重要作用。在子宫内膜样癌肿瘤组织中,PTEN蛋白与miR-21的表达呈负相关,提示两者可能共同参与了子宫内膜样癌的发病。[研究目的]1.体外实验在子宫内膜样癌细胞系中转染miR-21模拟物、miR-21抑制物的寡聚核苷酸,构建miR-21过表达和低表达模型。2.体外实验研究子宫内膜样癌细胞系中不同表达水平的miR-21对PTEN表达的影响。3.探讨miR-21异常表达对子宫内膜样癌细胞增殖、迁移及浸润等生物学行为的影响。[研究方法]1.用化学合成方法分别合成以miR-21成熟核苷酸序列为模板的miR-21模拟物(miR-21mimic),反义的miR-21抑制物(miR-21inhibitor)以及各自对应的阴性对照序列(Scrambled Control, SC)。通过脂质体Lipofectamine2000分别将miR-21模拟物、miR-21抑制物及各自对应的阴性对照序列转染入子宫2.应用实时荧光定量PCR方法检测转染后KLE中miR-21表达量的变化,进而运用Western Blot及实时荧光定量PCR方法检测不同miR-21水平对PTEN蛋白和mRNA基因表达产生的影响。3.用CCK-8试剂盒、划痕实验及侵袭实验分别检测不同水平miR-21对KLE细胞增殖、迁移及浸润功能的影响。[结果]1.MiR-21模拟物、miR-21抑制物及各自对应阴性对照序列均成功转染入KLE细胞中,转染效率约90%。2.转染后,与空白对照组相比,miR-21模拟物转染组中miR-21的表达增加了6.898±0.312倍(P=0.003),PTEN蛋白表达降低了53.8±2.7%(P=0.007),细胞生长速度、迁移速度及浸润能力均有明显增加(P<0.05)；相反,miR-21抑制物的转染使miR-21表达降低了33.4±5.4%(P=0.007),PTEN蛋白表达增加了1.888±0.147倍(P=0.002),并显著抑制了细胞的增殖、迁移及浸润能力(P<0.05)；但是,两组中的PTEN mRNA的表达与空白对照组相比,均没有明显变化(P>0.05)。[结论]MiR-21的过表达可显著降低PTEN蛋白的表达并促进KLE细胞的增殖、迁移及浸润,而miR-21的表达减低则可显著降低PTEN蛋白的表达并抑制KLE细胞的增殖、迁移及浸润,说明miR-21在子宫内膜样癌的发生发展过程中起到了一定的作用,同时也说明miR-21可能是子宫内膜样癌基因治疗的一个候选基因。PTEN是miR-21在子宫内膜样癌中的相关靶基因,miR-21可通过调节PTEN蛋白的表达来影响子宫内膜样癌细胞的生物学行为。