目的炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),到目前为止,该病的病因及发病机制尚未阐明,治疗缺乏特异性,没有治愈的方法,目前免疫异常被公认为在IBD的发病过程中具有极为重要的作用,而白细胞介素(IL)是其中最主要的具有多种生物活性的一组淋巴因子,本研究通过对IBD患者肠黏膜中IL-17、IL-23表达的研究,探讨IBD患者肠黏膜IL-17、IL-23的表达及与疾病的关系。材料和方法一、一般资料选择中国医科大学盛京医院2003年10月至2007年4月保存有完整资料的诊断明确的CD及同期UC住院患者活动期病变部位肠黏膜活检或手术标本,活动期CD组和UC组分别为8例和20例,正常对照20例。IBD的临床诊断均依据于典型的临床表现、常规影像学、内镜学及组织学标准。二、主要试剂1、兔抗人IL-17、IL-23单克隆抗体2、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒3、免疫组化过氧化物酶标志的链霉卵白素(SP)试剂盒显色试剂盒三、实验方法免疫组化检测:免疫组化染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(S-P)法。标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋。全部蜡块均行4μm厚连续切片,常规脱蜡至水,室温下3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶,微波修复抗原;滴加一抗(兔抗人IL-17、兔抗人IL-23,1:80,),4℃冷藏过夜后滴加二抗(山羊抗兔IgG,),于室温下孵育30分钟;DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。四、结果判定肠上皮细胞IL-17、IL-23染色结果评价参照文献进行,IL-17、IL-23染色为细胞质染色:组织切片中显示细胞质染为淡黄色至黄棕色者为阳性细胞标志,将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级:表达弱阳性(+),即阳性细胞数＜10%,显色强度为淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色;表达强阳性(+++),即阳性细胞数＞60%,多数细胞呈黄至棕黄色染色;表达中度阳性(++),即阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性之间。凡显色强度与背景无明显差别者为阴性。肠黏膜固有层内IL-17、IL-23表达以计数1000倍高倍镜下5个视野内平均阳性细胞百分数。上述结果均由两人双盲法独立判断,取其平均值。五、统计学处理实验所得数据采用SPSS10.0统计软件进行秩和检验及t检验,以p＜0.01为差异有统计学意义。结果肠黏膜IL-17、IL-23免疫组化染色显示,IBD患者结肠上皮细胞阳性为细胞质着色;黏膜固有层和淋巴小结内也可见散在阳性细胞。比较活动期UC、CD患者肠黏膜上皮细胞IL-17、IL-23表达,发现UC患者IL-17、IL-23阳性染色强度均高于CD患者,但二者差异无统计学意义(μ值分别为0.426、0.512,p值均＞0.01)。二者分别与正常对照组比较,均见显著性差异,其中UC组与正常对照组比较,IL-17、IL-23阳性染色强度均高于对照组,二者差异有统计学意义(μ值分别为4.898、4.513,p值均＜0.01)。CD组与正常对照组比较,IL-17、IL-23阳性染色强度亦均高于对照组,二者差异有统计学意义(μ值分别为3.251、3.316,p值均＜0.01)。比较活动期UC、CD患者肠黏膜固有层内阳性细胞百分数,发现UC患者IL-17阳性细胞百分数高于CD患者,而IL-23阳性细胞百分数低于CD患者,但二者差异无统计学意义(t值分别为1.599、1.825,p值均＞0.01);二者分别与正常对照组比较,均见显著性差异,其中UC组与正常对照组比较,IL-17、IL-23肠黏膜固有层内阳性细胞百分数均高于对照组,二者差异有统计学意义(t值分别为9.691、12.542,p值均＜0.01)。CD组与正常对照组比较,IL-17、IL-23肠黏膜固有层内阳性细胞百分数亦均高于对照组,二者差异有统计学意义(t值分别为2.891、8.298,p值均＜0。01)。讨论IBD在西方国家相当常见,近年我国报道的病例明显增多。目前普遍认为IBD的发病机制与遗传易感宿主对肠道菌丛的免疫应答失常有关,其中免疫调节异常和细胞信号转导通路是IBD研究最活跃的领域。Th17细胞是新近发现的一群效应性CD4~+ T辅助细胞亚群,其具高致病性,IL-17是一种促炎症细胞因子,是Th17细胞的主要效应因子,它具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞能力。此外,IL-17还可与炎症因子TNF2α等有协同作用,放大加强其致炎效应。本研究发现,活动期的IBD患者,UC和CD组结肠粘膜组织中IL-17高表达,而在正常对照组结肠粘膜组织中IL-17很少表达,提示在IBD患者结肠局部浸润的淋巴细胞中可能有Th-17细胞的存在。IL-23是与IL-12密切相关的细胞因子,由相同的p40亚基分别与p35、p19构成,IL-23驱动Th17细胞扩增及维持其存活,缺乏IL-23时,Th17细胞即明显减少。早期的IL-23功能学研究发现IL-23才是自身免疫性疾病的真正病因。本研究发现,活动期的IBD患者,UC和CD组结肠粘膜组织中IL-23高表达,而在正常对照组结肠粘膜组织中IL-23很少表达,提示IL-23参与了IBD患者结肠粘膜炎症反应。总之,本研究显示,活动期IBD患者肠粘膜IL-23、IL-17的表达较正常对照均有显著增强,提示IL-23、IL-17在IBD发生发展过程中发挥重要作用。IL-23通过诱导并驱动Th17细胞产生IL-17、IL-6和TNF2α,引起结肠炎症。目前研究证明,IL-23/IL-17轴在IBD的发病机制中可能处于关键地位,并有望成为IBD新的治疗靶标。结论白细胞介素-17、白细胞介素-23参与了炎症性肠病的发病过程,并可能在其发病过程中起着重要的作用。