共凝集细菌的筛选、鉴定及凝集机理初步研究

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共凝集是无亲缘关系的细菌通过细胞表面分子进行特异性识别进而凝集在一起的行为,在多菌种生物膜的发育与成熟中,共凝集影响了生物膜的形成和生物膜群落的多样性。调查发现很多细菌间会发生不同程度的共凝集,但是目前能与多个种属的细菌同时发生较强程度的共凝集、在多菌种生物膜形成中起到核心或桥梁作用的架桥细菌(Bridging bacterium)则只发现少数几种。为了筛选有广泛共凝集能力的架桥细菌,本文从市政污水、工业废水处理系统等7种生态系统的生物膜中分离到23株细菌,测定了细菌间共263个配对组合的共凝集率,结果显示,有3株细菌G5、G8和T1分别能与20株(占总测定菌株的91%)、20株(占总测定菌株的91%)和17株(占总测定菌株的77%)细菌配对发生共凝集率大于50%的共凝集,表现出广泛的共凝集能力;并且在成膜试验中,3株细菌在10%LB/5%LB培养液中,能分别使18/19、16/16和20/20株配对菌生物膜形成量增加,表现出促进生物膜形成的能力。经形态学、部分生理生化和16S rDNA序列鉴定,T1、G5和G8分别为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus和黄海芽孢杆菌Bacillus marisflavi。为了探讨理化环境对细菌间共凝集能力及共凝集体稳定性的影响,以T1与3株配对细菌G5、G8、H3(希瓦氏菌属Shewanella sp.)为材料,研究了细菌生长期、环境因子(温度、pH、水力剪切力)、表面活性剂(SDS、吐温80)、螯合剂(EDTA-Ca2+/Mg2+)及其他化学试剂(H2O2、琥珀酸)对共凝集能力及共凝集体稳定性的影响,结果表明:T1与G5配对在pH 5-9的酸碱度范围内共凝集率变化不大,但T1与G8或H3配对在pH 5时共凝集率有较大程度的降低,酸性条件对其共凝集能力有一定程度的影响;T1与3株配对菌在10℃-40℃时共凝集率均保持在较高的水平,在4℃低温和50℃高温条件下共凝集率较低,但未表现出对温度极端敏感的特性;T1与3株配对菌的共凝集率在静置条件下最高,但0-300 r/min的剪切力对共凝集率没有产生显著的影响;不同生长期的T1与3个配对菌的共凝集率均没有表现出显著差异,共凝集作用没有受到T1生长期的影响;Ca2+、Mg2+多价阳性离子的存在明显提高了3个配对菌的共凝集率,而表面活性剂(SDS、吐温80)或氧化剂(H202)的存在则降低了3个配对菌的共凝集率,表明T1与3株配对菌的共凝集能力对常规环境变化不敏感,但对表面活性剂和氧化剂敏感,这给我们污水处理实践共凝集菌的应用提供了一定的参考依据。为了探讨共凝集的分子机制,采用胰蛋白酶酶解(非特异性去除菌体表面蛋白)、80℃热激(检测热敏感性蛋白)、高碘酸钠氧化(非特异性去除菌体表面糖链)、琥珀酸酐酰化(非特异性酰化修饰凝集素,使其失去活性)和糖抑制试验(判断凝集素类型),初步探索了T1与配对菌G5、G8、H3和I1(蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus)的共凝集机制,结果显示胰蛋白酶处理和80℃热激T1后其共凝集能力下降(p<0.05),表明T1表面有热敏感性蛋白参与共凝集。T1用高碘酸钠氧化处理后,与I1或H3配对共凝集率有明显下降(p<0.05),而与G5或G8配对共凝集率没有明显变化;对T1进行琥珀酸酐酰化,T1与I1或H3配对共凝集率无明显变化,而与G5或G8配对共凝集率则明显下降(p<0.05),两项试验结果表明:T1表面的凝集素受体参与其与I1、H3的共凝集,T1表面的凝集素参与其与G5、G8的共凝集。结合T1与I1配对的共凝集能被50 mM的甘露糖和乳糖抑制(p<0.05):T1与H3配对的共凝集能被50 mM的N-乙酰-D-葡萄糖胺抑制(p<0.05);T1与G5或G8配对的共凝集分别被50 mM的D(+)-半乳糖和D-乳糖抑制(p<0.05),综合判断:T1表面拥有的甘露糖和乳糖敏感的凝集素受体、N-乙酰-D-葡萄糖胺敏感的凝集素受体、D(+)-半乳糖和D-乳糖敏感的凝集素分别参与与配对菌I1、H3、G5和G8的共凝集。与此相对应,Il表面为甘露糖型和乳糖型的凝集素;H3表面为N-乙酰-D-葡萄糖胺型凝集素;G5和G8表面参与反应的则分别为D(+)-半乳糖型凝集素受体和D-乳糖型凝集素受体。试验结果初步检测了T1表面参与共凝集作用的物质基础,为共凝集机制的进一步研究提供了参考依据。
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