研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、冠状动脉腔内成形术/支架植入术后再狭窄及脑卒中等动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）发病率和病死率在多数发展中国家仍呈逐年升高的趋势,是中国乃至全球范围内非感染性疾病死亡的首要原因。动脉粥样硬化（AS）是ASCVD的主要病理基础。在多种导致AS的不良因素作用下,位于中膜层的血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移至内膜及内膜下层并异常增殖,而内膜层的血管内皮细胞（VECs）凋亡增多,是AS发生发展的主要细胞病理学基础。然而,血管壁细胞异质性生物学行为异常及其介导AS发生的分子机制尚未完全明了。同源框（HOX）是一类进化上高度保守并影响脊索动物形态发生的同源域转录因子。HOX基因家族包含39个同源基因。近期研究表明,HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXB1及HOXB9等多个HOX基因在猪主动脉壁的表达受剪切应力影响,但这些基因对血管生物学功能和AS的影响未知。同源框C6（HOXC6）属HOX基因家族C簇成员。研究显示,HOXC6在多器官系统恶性肿瘤组织中表达增高并影响肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡等生物学行为。此外,HOXC6可调节血管壁多能干细胞分化为VSMCs、以及皮肤成纤维细胞分化为血管壁间充质细胞。但是,HOXC6对VSMCs和VECs的增殖、迁移及凋亡等生物学行为是否有影响迄今未见文献报道。研究目的了解Hoxc6等39个Hox基因在AS大鼠主动脉壁和正常主动脉壁的差异表达,然后进一步探讨HOXC6对VSMCs增殖及迁移和VECs凋亡的影响及其部分机制,为明确HOXC6能否成为ASCVD分子治疗新靶点奠定理论基础。研究方法采用苏木素和伊红（H&E）染色法对大鼠主动脉染色验证AS大鼠建模是否成功。应用免疫组织化学法检测Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉的原位表达。采用免疫荧光染色法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在VSMCs和CD31在VECs中的表达。采用反转录实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测39个Hox基因、p53、增殖细胞核抗原（PCNA）、磷脂酶C beta（PLCβ）和血小板活化因子受体（PTAFR）mRNAs表达。用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测大鼠主动脉或心脏组织中和大鼠VSMCs（RVSMCs）中Hoxc6、p53及PCNA蛋白表达,检测VECs中HOXC6、BCL-2、BAX、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、PTAFR、PLCβ及IL-18蛋白表达,以及检测VECs中蛋白激酶C zeta（PKCζ）、NF-κBp65磷酸化和PKCζ膜转位水平变化。应用Cell counting kit-8（CCK-8）和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Ed U）实验检测VSMCs增殖。用细胞划痕法和Transwell实验检测VSMCs迁移。用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）和流式细胞技术检测VECs凋亡。采用生物信息学分析方法挖掘并分析GEO数据库中冠心病相关基因表达及其可能参与的信号通路。应用双荧光素酶报告基因实验检测HOXC6与PTAFR启动子DNA序列结合。采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）结合qPCR（Ch IP-qPCR）验证HOXC6与PTAFR启动子DNA结合的特定靶序列。结果1.在AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因H&E染色结果显示,AS大鼠主动脉内膜/中膜比值较正常主动脉明显增加（P<0.01）。采用qRT-PCR对39个Hox基因mRNA检测结果显示,AS大鼠主动脉壁较正常大鼠主动脉壁表达上调或下调（表达增加或减少倍数的均数绝对值≥2）的Hox基因为17个,其中Hoxa1、Hoxa3、Hoxa9、Hoxb7、Hoxc5、Hoxc6、Hoxc8、Hoxc9及Hoxc10共9个基因表达上调（均P<0.01）,而Hoxa2、Hoxa4、Hoxa5、Hoxa6、Hoxb2、Hoxb3、Hoxb4及Hoxb6共8个基因下调（均P<0.01）。在上调的9个Hox基因中,其中Hoxc6表达升高了10余倍,较之升高倍数更大的Hoxc9或Hoxc10,Hoxc6在大鼠主动脉壁的基础表达丰度最高,而且重复性最好,因此首选Hoxc6作进一步验证。2.Hoxc6和增殖、凋亡相关分子在AS大鼠主动脉壁异常表达qRT-PCR和Western blot结果显示,Hoxc6 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达明显升高（P<0.01）,伴随p53 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达显著减少,而PCNA表达显著增多（均P<0.01）。免疫组化染色结果显示,在AS大鼠主动脉壁的粥样斑块病变和迁移至内膜的VSMCs中,Hoxc6蛋白的表达较正常主动脉显著增多（P<0.01）,伴随抑凋亡分子Bcl-2蛋白在AS大鼠主动脉壁增厚的内膜组织和粥样斑块病变中的表达较正常主动脉明显减少,而促凋亡蛋白Bax表达显著增多（均P<0.01）。3.敲低Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖与迁移免疫荧光染色实验结果显示,氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的RVSMCs用α-SMA抗体染色后,阳性细胞/细胞总数的比率较正常RVSMCs下降（P<0.05）。Ed U、CCK-8、细胞划痕及Transwell实验结果显示,ox-LDL作用于细胞后,RVSMCs增殖明显增多,细胞迁移能力显著增强（均P<0.01）,伴随p53蛋白表达减少,PCNA表达增多（均P<0.01）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RVSMCs中Hoxc6表达后,RVSMCs增殖显著减少,细胞迁移能力明显减弱（均P<0.01）,伴p53蛋白表达显著增多,而PCNA表达明显减少（均P<0.01）。此外,先后敲低RVSMCs中Hoxc6和p53表达后,RVSMCs的增殖和迁移能力较单独敲低Hoxc6组增强（均P<0.05）,但比正常对照组减弱（均P<0.05）。4.下调HOXC6表达抑制VECs凋亡TUNEL、流式细胞技术、qRT-PCR及Western blot结果显示,ox-LDL作用于大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）或人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后,细胞凋亡率较正常对照组均显著升高（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显著减少（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达增多（均P<0.05）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RAECs或HUVECs中HOXC6表达后,细胞凋亡率较正常对照组或单独ox-LDL处理组下降（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显著增多（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达减少（均P<0.05）。此外,在HUVECs中过表达HOXC6之后,HUVECs凋亡率和凋亡相关蛋白变化的趋势与抑制HOXC6表达时相反（均P<0.05）。5.HOXC6靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径影响HUVECs凋亡GEO数据库中冠心病有关的三个数据集gse20681、gse40231和gse46560取交集结果显示,血小板活化因子受体（PTAFR）等68个基因存在交集。KEGG pathway分析显示,PTAFR可通过PLC/PKC途径影响细胞凋亡,进一步在JASPAR数据库预测结果显示,HOXC6与PTAFR启动子存在特异结合位点。鉴于HOXC6影响RAECs和HUVECs凋亡的一致性,选择HUVECs为靶细胞,探讨HOXC6影响VECs凋亡的机制。qRT-PCR、Western blot结果显示,ox-LDL处理HUVECs或促进HOXC6表达后,PTAFR表达增多（均P<0.05）,伴随下游信号分子PLCβ表达增多（均P<0.05）,PKCζ磷酸化和膜转位水平升高（均P<0.05）,NF-κBp65磷酸化和IL-18表达水平升高（均P<0.05）。然而,在ox-LDL处理或正常培养的HUVECs中敲低HOXC6表达之后,上述观察指标的变化趋势与促进HOXC6表达时相反（均P<0.05）。此外,分别用PTAFR激动剂血小板活化因子和PKCζ激动剂溶血磷脂酰胆碱作用于HUVECs,均可逆转下调HOXC6表达所致的抑制HUVECs凋亡及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路活性的效应（均P<0.05）。而且,双荧光素酶报告基因实验结果显示,HUVECs中过表达HOXC6之后,HOXC6与PTAFR启动子结合的活性显著增高（P<0.01）。Ch IP-qPCR实验结果显示,HOXC6可与PTAFR启动子特定位点AGAGGAATAGATTAAA和（或）GAAGCAATCAACCAAG序列结合（P<0.01）。结论1.39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁与正常大鼠主动脉壁之间差异表达,其中Hoxc6表达显著升高,伴随p53和Bcl-2与Hoxc6呈负向性、而PCNA和Bax与Hoxc6呈正向性表达异常。2.HOXC6一方面可负调控p53表达而促进VSMCs增殖与迁移,另一方面靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进VECs凋亡。由此提示HOXC6影响VSMCs增殖、迁移和VECs凋亡的异质性。