基于功能纳米探针电化学免疫传感的食品中金黄色葡萄球菌高灵敏检测

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电化学免疫传感是将电化学技术与免疫识别技术相结合而发展形成的新型生物传感器。它主要是以抗原-抗体之间的特异性识别为基础,利用电化学工作站将生物化学信号转换成电信号,从而实现对待测物的定量检测。电化学免疫传感因其仪器简单、选择性好、灵敏度高、检测速度快等优点已成为金黄色葡萄球菌检测的重要手段之一。近年来,信号放大技术因其在提高免疫传感器的灵敏度方面起到了很大的作用而备受研究者关注。实现信号放大主要有两种方法:一是通过增大传感界面上捕获抗体的固载量实现信号的放大;二是利用生物酶或者模拟酶的催化性能设计纳米识别探针实现信号的放大。因此,本文构建了三种基于信号放大策略的电化学免疫传感器,并用于食品中金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。本论文的主要研究内容如下:1.基于CdTe量子点功能化碳纳米球电化学免疫传感的金黄色葡萄球菌检测研究构建了一种基于碲化镉量子点(CdTe QDS)功能化碳纳米球(CNS)的电化学免疫传感,并实现对金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。实验首先合成了粒径均匀的CdTe QDS和CNS,并利用带正电的壳聚糖(CS)将带负电的CdTe QDS功能化到带负电的CNS表面。接着利用EDC/NHS将抗体功能化到CNS@CdTe上合成CNS@CdTe-Ab功能纳米探针。同时在玻碳电极表面电沉积形成金纳米粒子,并通过Au-S键将捕获抗体固定到修饰电极表面构建电化学免疫传感器。然后基于菌-抗体之间的特异性免疫反应,将样品中的金黄色葡萄球菌识别到抗体功能化的电极上,并进一步将合成的纳米探针识别到金黄色葡萄球菌表面,最后溶出纳米探针中的Cd2+,并利用方波伏安法实现金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。实验还对影响免疫传感器检测性能的参数(如抗体浓度、免疫反应时间和检测液的pH)进行了优化。在最优的实验条件下,该免疫传感器的检测信号与金黄色葡萄球菌的浓度在1.21×1021.21×107CFU mL-1范围内具有较好的线性关系,检测限为47CFU mL-1。同时,该免疫传感器对非目标菌(如大肠杆菌、乳酸菌和副溶血弧菌)无明显的检测信号,表现出较好的检测特异性。实验还进一步利用该免疫传感器对实际样品中的金黄色葡萄球菌进行检测,检测的回收率在88.9%109.8%之间,相对标准偏差(RSD)在2.8%6.3%之间,结果表明该免疫传感器具有较好的应用前景。2.DNAzyme功能化金/铂纳米探针的合成及其对金黄色葡萄球菌的高灵敏检测建立了一种基于DNAzyme和链酶亲和素双功能化的金/铂纳米复合材料(Au@Pt)作为纳米探针的电化学免疫传感器。实验首先合成了海胆状的Au@Pt,并分别将链酶亲和素和巯基化的DNAzyme功能化到Au@Pt表面,利用Au@Pt以及DNAzyme对H2O2的催化作用,构建双重信号放大作用的纳米探针。同时,将GO@AuNPs纳米复合材料修饰在电极表面用来固定链酶亲和素,然后基于生物素与链酶亲和素之间的亲和反应,将生物素化抗体-菌的复合物识别到修饰电极表面,并进一步将纳米探针识别到金黄色葡萄球菌表面生物素化抗体上,最后利用电流-时间曲线进行电化学检测。实验还对影响免疫传感器检测性能的参数(如抗体浓度、免疫反应时间、亲和反应时间和H2O2浓度)进行了优化。实验结果表明,在最优的实验条件下,该电化学免疫传感器对金黄色葡萄球菌的线性检测范围为1.52×1021.52×107CFU mL-1,检测限为25CFU mL-1。该免疫传感器对金黄色葡萄球菌的检测还具有较好的重现性、稳定性和特异性。在实际样品的检测过程中,对金黄色葡萄球菌的回收率在90.4%110.8%之间,相对标准偏差在4.6%7.7%之间,表明该传感器可用于实际样品中金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。3.二茂铁二甲酸(Fc)功能化的聚苯乙烯-丙烯酸球(PSA)模拟酶信号放大策略的构建及其在电化学免疫传感中的应用研究建立了一种基于PSA@Fc纳米球模拟酶信号放大策略的电化学免疫传感器,并实现对食品中金黄色葡萄球菌的高灵敏检测。实验合成了粒径均一、分散均匀的PSA球,然后在光照的条件下将Fc聚合到PSA球表面制得PSA@Fc,接着利用EDC/NHS将抗体功能化到PSA@Fc上合成PSA@Fc-Ab纳米探针。该纳米探针可作为模拟酶催化过氧化氢,实现免疫传感器检测信号的放大。同时利用静电吸附作用将金纳米粒子(AuNPs)组装到玻碳电极表面实现抗体的固定,然后利用电极表面功能化的抗体捕获样品中的金黄色葡萄球菌,并进一步将纳米探针识别到金黄色葡萄球菌表面,最后利用差分脉冲伏安法进行电化学检测。实验还对影响免疫传感器性能的参数(如抗体浓度、免疫反应时间、检测液的pH和H2O2浓度)进行了优化。实验结果表明,在最优的实验条件下,该免疫传感器对金黄色葡萄球菌的线性检测范围为6.5×1011.3×107CFU mL-1,检测限为18CFU mL-1。在实际样品的检测过程中,对金黄色葡萄球菌的回收率在89.2%111.6%之间,相对标准偏差在2.51%7.32%之间,表明该免疫传感器具有较好的稳定性,在实际应用中具有一定的潜力。
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