【摘 要】
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日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属于扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),三角涡虫科(Dugesiidae),三角涡虫属(Dugesia),在动物系统演化中具有非常重要的地位,其再生能力极强,已成为再生生物学和发育生物学研究的模式动物。本文从日本三角涡虫转录组数据库中筛选出与细胞自噬相关基因Atg1的三个同源基因:DjAtg1-1、DjA
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日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属于扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),三角涡虫科(Dugesiidae),三角涡虫属(Dugesia),在动物系统演化中具有非常重要的地位,其再生能力极强,已成为再生生物学和发育生物学研究的模式动物。本文从日本三角涡虫转录组数据库中筛选出与细胞自噬相关基因Atg1的三个同源基因:DjAtg1-1、DjAtg1-2和DjAtg1-3。利用生物信息学分析、原位杂交、RNAi、免疫荧光、Rt-PCR以及透射电镜(TEM)等分子生物学技术对这三个基因的功能进行分析,结果如下:(1)DjAtg1-1基因的cDNA含有一个最大开放阅读框(ORF),大小为1458bp,编码一个由485个氨基酸组成的蛋白质。DjAtg1-2基因的cDNA含有一个最大开放阅读框(ORF),大小为833bp,编码一个由243个氨基酸组成的蛋白质。DjAtg1-3基因的cDNA含有一个最大开放阅读框(ORF),大小为2445bp,编码一个由814个氨基酸组成的蛋白质。利用生物信息学分析了DjAtg1-1、DjAtg1-2和DjAtg1-3推导的氨基酸的结构和进化地位,结果显示:DjAtg1-1、DjAtg1-2和DjAtg1-3编码的蛋白质都含有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(S_TKc)催化结构域,属于Atg1家族的亲水性蛋白。(2)整体原位杂交结果表明,DjAtg1三个基因在整体涡虫中,杂交信号主要分布在身体两侧;在再生涡虫中,杂交信号主要分布在身体两侧及芽基处,在再生第3d杂交信号相对较强。(3)DjAtg1-1和DjAtg1-2干扰后,整体组和再生组的涡虫与对照组相比,形态学上无明显变化。同时Rt-PCR结果表明:DjAtg1-2、DjAtg1-3、干细胞标记基因DjPiwiA表达量显著上调,细胞周期调节基因DjcyclinA/B、Djcdk、干细胞增殖标记基因Djpcna表达量显著下调。DjAtg1-3被干扰后,头再生尾片段再生速度减慢,而整体和尾再生头组与对照组涡虫相比,形态学上无明显变化。同时Rt-PCR结果表明:DjAtg1-1、DjAtg1-2、DjpiwiA、DjcyclinA,DjcyclinB表达量显著下调。(4)免疫荧光结果提示:DjAtg1-1与DjAtg1-2被干扰后,实验组与对照组相比H3P~+细胞数量显著增加;DjAtg1-3被干扰后,实验组与对照组相比H3P~+细胞数量显著减少。(5)透射电镜结果显示:DjAtg1-1与DjAtg1-2基因干扰后不影响自噬体形成,DjAtg1-3基因干扰后抑制自噬发生。研究结果提示:日本三角涡虫中DjAtg1三个基因参与细胞自噬以及干细胞的增殖;DjAtg1三个基因之间可能存在互补作用,而DjAtg1-3则控制DjAtg1-1与DjAtg1-2的表达;DjAtg1-3影响涡虫再生和身体重塑,在再生早期起重要作用。
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