【摘 要】
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目的:细胞稳态是细胞生理活动的基础,细胞稳态的失衡极易诱导细胞走向肿瘤化或是凋亡。因此探究细胞维持稳态的机制是研究肿瘤发生发展的重要前提。为了维持细胞稳态,细胞自生存在一系列的机制,例如细胞周期检验点、自噬等方式。细胞周期检验点的存在使得细胞可以暂时停在各个时期以便修复细胞损伤、等待外源刺激信号消失或等待生长因子、激素和营养的供给。自噬则是通过自噬小体与溶酶体融合后降解和再回收多种细胞成分,例如长
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目的:细胞稳态是细胞生理活动的基础,细胞稳态的失衡极易诱导细胞走向肿瘤化或是凋亡。因此探究细胞维持稳态的机制是研究肿瘤发生发展的重要前提。为了维持细胞稳态,细胞自生存在一系列的机制,例如细胞周期检验点、自噬等方式。细胞周期检验点的存在使得细胞可以暂时停在各个时期以便修复细胞损伤、等待外源刺激信号消失或等待生长因子、激素和营养的供给。自噬则是通过自噬小体与溶酶体融合后降解和再回收多种细胞成分,例如长寿蛋白和受损伤细胞器等,为细胞提供营养物质。因此代谢压力下,探究细胞维持稳态的机制可以为肿瘤的发生发展过程提供新的视角。自噬相关蛋白7（Autophagy Related Protein 7即Atg7）作为E1样泛素活化酶参与到了 Atg12与Atg5的共价结合以及Atg8与磷脂酰乙醇胺脂（PE）的结合是自噬环节中重要的蛋白。通过质谱分析我们发现Atg7能够与抑制蛋白合成的因子即负性调控蛋白相互作用,减少非必要蛋白的生成进一步增加细胞内可以利用的营养物质。程序性死亡蛋白4（Programmed cell death protein 4即PDCD4）则是这一类蛋白的代表之一。PDCD4是一种负性调控蛋白,可以通过其结构中与MA1同源的MA3结构域竞争性结合eIF4（eukaryotic initiation factor 4A）从而抑制RNA解螺旋及其相关的蛋白翻译。因此我们猜测为了应对代谢压力,Atg7能够通过自噬“产生”营养成分,通过PDCD4抑制非必要蛋白合成,“开源节流”,同时使细胞周期阻滞等待外源营养物质供给使细胞平安度过压力期,避免走向死亡。我们的研究基于Atg7对蛋白质的降解能力,发现Atg7通过上调PDCD4的磷酸化水平使其泛素化降解增加。代谢压力下Atg7与PDCD4的相互作用减弱,使PDCD4 Ser67磷酸化水平减弱,泛素化降解减少,PDCD4蛋白水平上升。通过影响p21、Cdc2、Cdc25C等周期相关蛋完成G1期细胞周期阻滞,减少细胞凋亡。方法:1、利用免疫共沉淀实验、GST-Pulldown、免疫荧光实验验证Atg7与PDCD4的相互作用关系。2、利用Western blot实验探索Atg7对PDCD4蛋白修饰即磷酸化修饰和泛素化修饰的影响。3、利用免疫荧光实验和Western blot实验验证Atg7对PDCD4蛋白半衰期的影响。4、利用流式细胞术和Western blot实验探究代谢压力下Atg7与PDCD4在细胞周期及凋亡中的作用机制。结果:1、Atg7与PDCD4为直接互作蛋白。2、过表达Atg7促进PDCD4 Ser67磷酸化,敲除Atg7减弱PDCD4 Ser67磷酸化。3、过表达Atg7促进AKT与PDCD4结合,敲除Atg7后AKT与PDCD4结合明显减弱。4、Atg7通过促进PDCD4泛素化水平降解PDCD4,改变其半衰期。5、过表达PDCD4促进p21蛋白表达增加,降低Cdc2、Cdc25C蛋白水平。6、敲减PDCD4挽救Atg7缺失引起的细胞周期紊乱（p<0.001）。7、敲减PDCD4挽救Atg7缺失引起的细胞凋亡（p<0.01）。结论:1、AKT、Atg7、PDCD4三者存在相互作用。2、Atg7促进AKT依赖的PDCD4 Ser67磷酸化,降解PDCD4。3、代谢压力抑制Atg7-PDCD4通路阻滞细胞减少细胞凋亡。
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