1.背景与目的美国癌症协会数据显示,恶性肿瘤是世界范围内导致死亡的最主要疾病之一,其中超过90%的恶性肿瘤患者因为肿瘤的转移而死亡。根据目前研究,恶性肿瘤细胞侵袭转移的模式包括局部浸润、血管侵袭、血管内运输、血管内聚集、外渗、微转移灶形成和休眠,最终在某些刺激下血管生成,形成新的转移灶。而在外周循环中运输的肿瘤细胞就被称为循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)。近年来,随着人们在不同肿瘤患者体内发现了循环肿瘤细胞,CTCs逐渐成为更多学者研究的对象,且CTCs在临床预后、疾病分期、疾病复发、肿瘤转移、疗效分析和预测患者生存状况等方面都显示出特殊价值。越来越多的文献表明CTCs是一个新出现的能够评估肿瘤复发风险、指导和监测临床治疗效果的独立指标。但是,目前公认的CTCs检测方法依赖于肿瘤细胞的物理特征和分子表面标记,其敏感性、特异性都存在缺陷,所以如何能从亿万外周循环细胞中特异、高效地识别出极少数的肿瘤细胞是一个难题,也是我们去突破这一难题的关键。随着肿瘤分子生物学的不断发展,人们利用基因方法来改造和构建野生型病毒,从而使病毒具有特异性识别肿瘤细胞的能力；而腺病毒因其性质稳定、感染范围广、感染效率高、毒性低、安全系数高等特点成为研究的焦点。本课题基于以上观点出发,通过基因工程来改造构建新的复制选择性溶肿瘤腺病毒。Ad11-Te1-GFP利用端粒酶启动子调控病毒在肿瘤细胞内的复制,从而在感染病毒的细胞内表达绿色荧光蛋白,通过荧光显微镜从亿万白细胞中准确地发现恶性肿瘤细胞。更重要的是,采用这种方法发现的恶性肿瘤细胞都是能够在外周血中存活的、具有高转移能力的活细胞,这一点对患者的预后判断可能更加具有指导意义。目前,关于CTCs在临床应用的研究大部分集中在乳腺癌、前列腺癌和结肠癌,与肺癌相关的资料很少,而我国肺癌患者人数占世界第一位,发病人数也逐年快速上升。所以,本实验着眼于复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-Te1-GFP在对肺癌CTCs检测中的应用,为探讨肺癌患者CTCs的临床意义提供新的有效方法。2.方法选取肺癌细胞系A549和H1299,将两株细胞分别消化计数后加入10%DMEM中,不同病毒浓度梯度和时间梯度37℃孵育后对细胞进行固定和DAPI染色,然后在荧光显微镜下观察表达GFP细胞的个数,计算阳性率。未感染病毒的肿瘤细胞作为阴性对照将两株细胞分别消化计数后加入7.5ml健康人全血中,经过红细胞裂解、37℃孵育、固定和DAPI染色,荧光显微镜下观察表达GFP细胞的个数,计算阳性率,未加肿瘤细胞的全血为阴性对照。实验结果使用SPSS17.0进行统计处理。3.结果(1)经过研究改建的复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-Tel-GFP能够特异识别和感染A549和H1299两株肺癌细胞,病毒在细胞中选择性复制并表达GFP。(2) Ad11-Tel-GFP对感染血液中的人肺癌细胞系A549、H1299细胞其平均阳性表达率无明显的统计学意义(p=0.435,α=0.05),说明病毒对不同肺癌细胞系有着相同的感染能力。(3)复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-Tel-GFP不感染人白细胞。(4)在人肺癌细胞系模拟实验中,本方法的灵敏度可达到90%。4.结论经本实验室研究构建的复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-Tel-GFP可以特异性识别、感染外周血中肺癌细胞并在其中大量复制从而表达GFP,为肺癌CTCs检测提供一种简单、高效的新方法。