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COMT(Catechol-O-methyltransferase,儿茶酚-O-甲基转移酶)是人体内一种重要的的二相代谢酶,可以代谢内源性和外源性儿茶酚类化合物,对机体的防御也起着重要的作用。COMT的催化功能(即活性)是其在机体发挥功能的前提条件,COMT催化功能的失常会导致人体多种疾病的发生甚至死亡。因此,评价和表征COMT催化功能十分重要。基于特异性探针分子检测目标酶催化功能的手段已得到普遍认同,但现行COMT催化功能表征探针及检测体系受以下条件制约或有以下缺陷:1.原理上,需要定量检测酶代谢的专一产物,特别是单一产物的生成量,而不是底物的减少量;2.COMT具有两种形式,在生理状态下底物的选择性并没有差异,所以对COMT活性的评价是同时评价两种类型COMT的活性;3.COMT即是膜蛋白也是游离蛋白,其催化功能需要膜结构的完整性或胞浆和辅因子的存在,反应体系的复杂性影响到不同生物基质或/和内源性物质对COMT催化表征的稳定性和抗干扰性;4.COMT活性常常需要活细胞水平的检测,因此,底物探针或者代谢产物不能对活性细胞体系形成毒性伤害;5.已报道的COMT探针底物均为非荧光底物,未经理性设计和优化,反应检测体系需要借助高效液相色谱-紫外或高效液相色谱-质谱等大型贵重仪器来实现产物的分离与检测,具有流程繁琐、测试通量低、成本高、生物基质干扰大等缺陷。针对上述在选择性、稳定性、灵敏性、抗干扰性、实用性等方面的挑战和限制,本论文开展了以下工作,1.以高灵敏性和抗干扰性较好的香豆素荧光分子为母体,构建了4位取代不同,极性大小不同的小分子荧光化合物库8个,最终发现COMT能够高选择性的将探针DHMC(4-methyl-7,8-dihydroxycoumarin,7,8-二羟基-4-甲基香豆素)甲基化成HMMC(4-methyl-7-hydroxy-8-methoxycoumarin,7-羟基-8-甲氧基-4-甲基香豆素);2.利用体外重组单酶,系统研究了探针对底物的选择性;3.结合COMT偏好的底物结构特征,通过选择香豆素7,8位儿茶酚COMT代谢的倾向性和代谢选择性,发现COMT选择性代谢8位羟基,只产生一个产物;4.对COMT荧光底物及其相应甲基化产物的探针性能,包括荧光量子产率、p H稳定性、激发和发射波长等和COMT酶反应动力学特征进行了系统评估,发现荧光探针具有很好的稳定性和抗干扰能力;5.将新发现的探针和反应检测体系进行了生物应用,包括1)人源性组织或生物样本中COMT酶活的定量测定,结果发现COMT活性检测与传统COMT定量方法结果一致;2)人源性肿瘤细胞中COMT的生物成像,表明DHMC能够用于体外细胞生物成像,检测细胞中COMT的活性;3)高通量筛选COMT抑制剂,表明DHMC能够用于高通量筛选COMT抑制剂。所有结果均表明,COMT荧光探针DHMC在药物发现或是检测活细胞中COMT的生物学功能都有很大的前景。