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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原是PRRS病毒(PRRSV),是一种危害严重的病毒性疫病,给全球养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV非结构蛋白9(Non-structural protein 9,Nsp9)有RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp)功能,对病毒复制至关重要。另外,Nsp9序列相对保守,是理想的抗PRRSV靶标。实验室前期研究发现在MARC-145细胞中稳定表达Nsp9特异性纳米抗体Nb6能抑制PRRSV复制。同时,还证明了Nb6与细胞穿膜肽(Cell penetrating peptide,CPP)融合表达的重组蛋白能进入宿主细胞并发挥抗病毒功能。然而,Nb6通过靶向Nsp9抑制PRRSV复制的抗病毒机制尚不清楚,此外,Nsp9的三维结构未知。本研究使用X-射线小角散射(Small-angle X-ray scattering,SAXS)技术,获得了Nsp9以及Nsp9-Nb6复合物的分子包膜信息,同时鉴定了参与Nsp9-Nb6相互作用的重要氨基酸位点。在此基础上,本研究进一步通过反向遗传技术构建了突变这些氨基酸位点的重组病毒,体外评估了突变病毒的复制效率,确定了影响PRRSV复制的关键氨基酸。另外,获得并解析了Nsp9特异性纳米抗体Nb7的高分辨率晶体结构(1.8?)。本研究为抗PRRSV感染以及开发基于结构的抗病毒药物提供了试验依据。本论文的研究内容及结果如下:1.使用阴离子交换柱、Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化Nsp9重组蛋白,获得了纯度较高的重组蛋白并对其进行了结晶;通过I-TASSER在线服务器预测了全长Nsp9的结构,总体结构分为两个部分呈上窄下宽的桶形;根据此预测结构以及前期文献报道将Nsp9截短表达;使用动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)方法检测了Nsp9重组蛋白在溶液中的粒径大小,结果表明此Nsp9重组蛋白溶液是均一的,单分散的;将不同浓度的Nsp9重组蛋白进行SAXS分析,最终获得了Nsp9重组蛋白的大分子包膜,其大分子包膜不对称且呈桶形。2.扩增Nb6/Nb7基因并将其克隆到p MECS载体中,构建p MECS-Nb6/Nb7重组表达载体;将载体转化BL21感受态细胞,诱导后,经验证Nb6/Nb7重组蛋白在大肠杆菌周质中成功表达;重组蛋白使用Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化获得了高纯度蛋白;接下来,将Nb6/Nb7基因克隆到p PICZαA载体,构建p PICZαA-Nb6/Nb7重组表达载体;重组表达载体经线性化后电转化毕氏酵母菌株X-33感受态细胞;甲醇诱导后,经SDS-PAGE分析表明Nb6/Nb7重组蛋白在细胞上清中大量的分泌表达;Nb6/Nb7经Ni-NTA和凝胶过滤层析柱纯化,获得了高纯度的重组蛋白;结晶酵母表达的Nb6/Nb7的晶体并收集数据,Nb7重组蛋白的晶体具有较好的衍射,最终获得了1.8?高分辨率衍射数据,每个不对称单元中有两个Nb7,重组蛋白的形状总体呈现紧致的圆柱形,并且没有长的CDR3,这与其他的纳米抗体不一样。3.将纯化的Nsp9重组蛋白和过量Nb6重组蛋白孵育,通过凝胶过滤层析柱纯化,获得Nsp9-Nb6复合物;使用生物膜干涉技术(Bio-layer interferometry,BLI)分析了Nsp9与Nb6之间的亲和力大小,结果表明Nsp9与Nb6具有高亲和力;DLS分析显示Nsp9-Nb6复合物溶液是均一的;将不同浓度的Nsp9-Nb6复合物进行SAXS分析,获得了Nsp9-Nb6复合物在溶液中的结构信息数据,最终获得了Nsp9-Nb6复合物的大分子包膜信息;通过将复合物的大分子包膜和Nsp9单体的大分子包膜分析比较后确定了Nsp9-Nb6相互作用模型。在此模型中,复合物的相互作用是通过Nsp9的Ile588、Asp590、Leu643和Asp646与Nb6的Trp105、Pro107、Tyr62和Asp64介导的;使用BLI和ELISA方法验证Nsp9和Nb6之间相互作用的氨基酸,结果表明,Nsp9的588、590和643位氨基酸和Nb6的62、105和107位氨基酸参与了二者的相互作用;以高致病PRRSV(Highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)SD16株感染性克隆为骨架,构建了Nsp9的第588位、590位和643位氨基酸替换的重组病毒;在MARC-145细胞上的复制动力学表明,第588位和643位氨基酸替换的突变病毒较其亲本毒复制效率明显降低并且其负链基因组RNA水平与其亲本病毒之间也存在明显差异。综上所述,本研究首次使用SAXS方法获得了Nsp9和Nsp9-Nb6复合物的分子包膜,并鉴定出对PRRSV复制至关重要的Nsp9的两个新的氨基酸。这些发现丰富了有关PRRSV Nsp9以及病毒复制和致病性的知识,有助于开发抗PRRSV感染的药物和新型疫苗。