微管在细胞分裂、分化,细胞形态决定及胞内物质运输等生理活动中起重要作用。植物有不同于动物的微管列阵,如周质微管列阵、早前期带和成膜体。在植物细胞的分裂、生长和发育过程中,微管列阵会依次转换。微管列阵的转换需要微管结合蛋白的参与。植物微管结合蛋白的研究是目前植物细胞骨架研究的前沿领域。 MAP1B是动物神经元细胞中的微管结合蛋白,用它的微管结合域的特征序列与拟南芥基因组比对,发现了一个功能未知的基因(At5g44610),其开放阅读框编码168个氨基酸,分子量为18.5 kDa,有8个类似MAP1B微管结合域的VVEKKN/EE不完全特征重复序列,因此推测其为一个微管结合蛋白。 我们通过克隆,原核表达,并纯化了该蛋白。通过共沉淀实验证明了它与微管结合。用绿色荧光染料Alex 488标记该蛋白,与红色荧光的罗丹明标记的微管蛋白在微管聚合缓冲液中共同孵育,结果显示它与体外聚合的微管共定位。证明这是一个新的微管结合蛋白,因此将它命名为AtMAP18。 激光共聚焦显微镜的观察结果表明AtMAP18虽然结合微管但是没有使微管形成微管束的效应。利用体外微管聚合系统的实验结果表明,AtMAP18对微管蛋白的聚合有影响,这种影响依赖于AtMAP18的浓度。低浓度的AtMAP18促进微管聚合,而高浓度的AtMAP18抑制微管聚合。但是,EDC交联实验表明AtMAP18不与微管蛋白单体结合。 为了研究AtMAP18的基因表达模式,构建了AtMAP18启动子-GUS质粒,并转化拟南芥植株。GUS活性检测结果显示:AtMAP18主要在根、花、果荚、子叶、下胚轴、表皮毛等器官和组织中表达。以原核表达的AtMAP18为抗原制备了抗AtMAP18抗体。Western blot实验也同样证明AtMAP18蛋白主要存在于拟南芥根和花等器官的组织中。 为了研究AtMAP18的生理功能,构建相应的质粒转化拟南芥,筛选获得AtMAP18过表达和RNAi转基因植株的纯合体株系。在RNAi转基因植株未发现明显的表型,但是在AtMAP18过表达的纯合体株系中,细胞发生了广泛的与细胞异向性生长相关的细胞形态异常:叶和子叶的铺板细胞、根的表皮细胞和根毛、下胚轴表皮细胞和皮层细胞与野生型同一部位的细胞相比,细胞形态都发生了改变;铺板细胞突起数明显减少,细胞边缘光滑;根和下胚轴表皮细胞肿胀;花粉形态异常,异常花粉没有内含物,不能正常萌发。 进一步对AtMAP18对细胞中微管骨架的作用进行了研究。免疫荧光双标记的观察结果表明拟南芥根的细胞中AtMAP18与细胞周质微管共定位。将AtMAP18连上红色荧光蛋白转化GFP-tubulin拟南芥,观察结果显示AtMAP18在子叶和下胚轴细胞中也与细胞周质微管共定位。对AtMAP18过表达植株中子叶铺板细胞微管和下胚轴表皮细胞微管观察显示,微管的排列即微管列阵与野生型的相比发生改变。AtMAP18过量表达使微管列阵的动态转换被抑制,导致细胞形态的改变。 本学位论文首先证明了AtMAP18是一个新发现的植物细胞微管结合蛋白,并对AtMAP18的生理功能进行了分析,证明了AtMAP18在对细胞微管骨架的组织和调控方面有作用,并进一步在植物细胞生长的调控和形态建成方面有重要的功能。