论文部分内容阅读
背景卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁妇女生命和健康,恶性程度高、起病隐匿、发病晚、易转移、预后差是卵巢癌的特点。大约70%的患者因为腹水、腹痛等原因就诊时已经是晚期(FIGO分级Ⅲ-Ⅳ期)。肿瘤细胞减灭术和以顺铂为基础的联合化疗是晚期卵巢上皮性癌综合治疗的重要手段[1],肿瘤细胞减灭术的目的是最大限度和范围地切除肿瘤组织,但多年临床经验表明,术后可能残留的病灶仍然无法避免,且成为卵巢癌复发的重要因素。因此化疗的应用使卵巢癌的治疗效果大为改观,患者生存质量明显改善,但综合来看,患者5年内的生存率仍徘徊于30~40%,卵巢癌对化疗药物耐药是导致患者治疗失败的主要原因。目前卵巢上皮性癌主要采用以顺铂为基础的化疗方案,顺铂通过使肿瘤细胞形成DNA加合物,造成肿瘤细胞的DNA损伤,继而使肿瘤细胞DNA的复制被抑制,细胞分裂再生停止,最终杀灭肿瘤细胞。然而,顺铂的疗效会因癌细胞内在或者后天(药物诱导)获得的耐药性而减弱。到目前为止,对顺铂的体内耐药机制并不完全清楚,但是其中核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)途径对铂类药物形成的DNA加合物的切割修复在肿瘤对铂类药物的耐药过程中起着非常重要的作用[2],而在NER途径中的切除修复交叉互补蛋白1(excision repair crosscomp lementing p rotein1,ERCC1)是最重要的一个修复蛋白。ERCC1在降低肿瘤细胞对铂类化疗药物的一个可能性是因为它能够及时地修复铂类造成的DNA损伤[3]。沉默或干扰掉ERCC1基因可以增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[4]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kases,MAPK)信号通路在多种恶性肿瘤(包括卵巢癌)细胞的增殖、凋亡和化疗药物作用及化疗药物耐受发生中起重要作用[5-7],在多数肿瘤中都存在不正常激活或异常表达。有研究表明,p38MAPK信号通路的过度激活能够导致卵巢癌的发生和影响其预后[8]。MAPK信号通路在非小细胞癌等多种肿瘤细胞的ERCC1基因高表达中起到重要作用[9]。二甲双胍是一种常规用于治疗2型糖尿病的口服降糖药[10,11]。最近两项大型流行病学调查研究表明:长期服用二甲双胍能够降低卵巢癌的发病率,而且二甲双胍能够显著延长卵巢癌合并糖尿病患者的无进展生存期[12]。在体内外实验研究中,二甲双胍能够抑制包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞的生长和发展[13,14]。特别是二甲双胍能够增加非小细胞癌细胞、卵巢癌细胞等对化疗药物的敏感性[15],已有报道称,二甲双胍能够改善乳腺癌化疗药物耐药的耐药性,但具体机制不明[16]。本研究通过CCK-8法检测人上皮性卵巢癌细胞耐药株细胞C13K和CP70细胞的增殖、顺铂耐药性及二甲双胍对其的顺铂耐药性改变,应用si RNA转染技术分别抑制耐药细胞株中ERCC1、p38MAPK基因的表达,RT-PCR法检测应用二甲双胍前后的耐药细胞中的ERCC1基因的m RNA的表达情况,同时western blot方法检测ERCC1、AMPK、p-AMPK、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达,探讨ERCC1基因对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响,以及二甲双胍应用后卵巢癌细胞顺铂耐药性的变化情况,试图进一步了解二甲双胍能否改善顺铂耐药性,以及以及是否通过调节p38MAPK信号通路降低细胞中ERCC1基因的表达从而发挥作用,以期对卵巢癌的化学治疗提供新的理论依据。目的通过细胞增殖实验(CCK-8)、荧光定量PCR、western blot技术分析二甲双胍对卵巢癌细胞顺铂耐药株耐药性的改善,以及通过si RNA转染技术分别抑制耐药细胞中ERCC1和p38MAPK基因的表达,分析二甲双胍影响卵巢癌以上生物学行为的分子机制,为逆转卵巢癌耐药研究以及临床应用提供一个新的思路。方法1.siRNA转染抑制C13K和CP70细胞中ERCC1、p38MAPK基因的表达;2.细胞增殖法(CCK-8)检测转染ERCC1si RNA前后耐药细胞的顺铂耐药性的改变、二甲双胍对耐药细胞顺铂耐药性的改善;3.应用荧光定量PCR(RT-PCR)或/和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测二甲双胍作用前后耐药细胞中ERCC1的表达改变、AMPK信号通路、p38MAPK信号通路变化情况;3.统计学处理:利用SPSS17.0软件对结果数据进行统计分析。所有实验均独立重复3次,多组间数据采用单因素方差分析,然后组间两两比较采用LSD-t法进行比较。依P<0.05为差异有统计学意义。结果1.二甲双胍能够逆转C13K和CP70细胞对顺铂的耐药性(P<0.05)。2.二甲双胍作用能够降低C13K和CP70细胞中ERCC1 m RNA和蛋白的表达水平(P<0.001),并激活AMPK信号通路(P<0.01);而联合应用AMPK信号通路阻断剂Compound C可以阻断二甲双胍的这种作用(即ERCC1蛋白表达升高)(P<0.001)。3.p38MAPK信号通路抑制剂SB203580作用耐药后,细胞中ERCC1蛋白表达水平降低(P<0.05);而二甲双胍作用可降低p38MAPK的磷酸化水平(P<0.001),抑制p38MAPK信号通路;二甲双胍作用转染了p38MAPK si RNA的C13K和CP70细胞后,ERCC1蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05)。结论1、ERCC1基因可能参与卵巢癌C13K和CP70细胞对顺铂的耐药性形成;2、二甲双胍能够逆转C13K和CP70细胞的顺铂耐药性;3、二甲双胍可能通过调节AMPK信号通路、p38MAPK信号通路调节C13K和CP70细胞的顺铂耐药性。