论文部分内容阅读
第一部分血吸虫卵对肠粘膜紧密连接蛋白表达和分布的影响目的:研究血吸虫卵对TNBS(2,4,6—三硝基苯磺酸2,4,6-trinitrobenzesulfonic acid TNBS)诱导小鼠结肠炎肠粘膜紧密连接蛋白Zonula occludens-1(ZO-1)、Occludin基因及蛋白表达和分布水平影响并探讨其机制。方法:建立三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎模型,实验小鼠(n=50)随机分成三组:正常对照组(A组,n=10)、TNBS+生理盐水组(B组,n=20)、TNBS+血吸虫卵组(C组,n=20)。C组在造模前第14、3天分别给予腹腔注射冰冻灭活血吸虫卵10,000个(1ml冰生理盐水混悬液)。B组同时给予相同体积的冰生理盐水腹腔注射。B组及C组小鼠予3mgTNBS溶液/只灌肠建立结肠炎模型,建模后第7天处死存活小鼠,观察三组小鼠结肠的大体形态、H-E染色光镜下病理特征(Ameho-vriteria评分法);同时用荧光实时定量PCR(Realtime-Polymerasechain reaction)法测定结肠组织的Occludin、ZO-1的mRNA基因表达,免疫印迹(Western blotting)方法测定结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达,免疫组化方法测定结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达分布。结果:(1)与TNBS肠炎组死亡率30%相比,血吸虫卵组小鼠为15%,死亡率明显下降(P＜0.05)。(2)结肠肉眼及组织病理炎症程度明显减轻,Ameho-criteria评分法结肠组织病理评分TNBS肠炎组4.21±0.4,血吸虫卵组1.74±0.1(P＜0.05)。(3)实时定量PCR分析结肠组织粘膜Occludin mRNA相对表达量TNBS肠炎组(B组)较正常组(A组)显著下降(0.0427±0.005 vs 0.008±0.001 P＜0.05);血吸虫卵处理组(C组)Occludin mRNA相对表达量增高,与TNBS肠炎绀(B组)有显著差异(0.0297±0.006 vs 0.008±0.001 P＜0.05);结肠组织粘膜ZO-1 mRNA相对表达量:TNBS肠炎组(B组)较正常组(A组)显著下降(0.00258±0.002 vs0.00937±0.04,P＜0.05),血吸虫卵处理组(C组)ZO-1 mRNA相对表达量明显增加,与TNBS组(B组)有显著差异(0.00746±0.01 vs 0.00258±0.002,P＜0.05)(4) Western blotting分析显示:ZO-1、Occludin在三组肠粘膜中均有表达,Occludin在正常组(A组)、TNBS肠炎组(B组)、血吸虫卵组(C组)相对灰度值分别为:1.592±0.06、0.837±0.05、1.439±0.04;TNBS肠炎组较正常组下降46.7%(P＜0.05);血吸虫卵组较TNBS肠炎组增加39.7(P＜0.05),有显著统计学意义;ZO-1相对灰度值分别为:1.278±0.03,0.649±0.02,1.196±0.06;TNBS肠炎组较正常组下降50.3%(P＜0.05);血吸虫卵组较TNBS肠炎组增加42.3%(P＜0.05),有显著统计学意义。(5)免疫组织化学显示:ZO-1、Occludin蛋白染色强度TNBS肠炎组分布与正常对照组有显著差异(P＜0.01)血吸虫卵组染色强度信号分布较TNBS肠炎组显著增加,有统计学差异(P＜0.05)结论:(1)冰冻灭活血吸虫卵能够显著改善TNBS诱导小鼠结肠炎模型的肠道炎症反应。(2)血吸虫卵能在细胞水平上加强紧密连接蛋白ZO-1、Occludin聚集及表达,通过稳定紧密连接蛋白,增加肠道粘膜屏障功能,预防炎症性肠病。第二部分血吸虫卵对肠粘膜NOD2/CRAD15表达影响目的:研究TNBS诱导结肠炎小鼠肠粘膜NOD2基因及蛋白表达,及血吸虫卵处理后NOD2表达改变。方法:建立三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎模型,方法同第一部分,建模后第7天处死存活小鼠,用荧光实时定量PCR(Realtime-Polymerasechain reaction)法测定结肠组织的NOD2的mRNA基因表达,免疫印迹(westernblotting)方法测定结肠组织NOD2蛋白表达水平。结果:(1)实时定量PCR分析显示TNBS肠炎组较正常组结肠粘膜NOD2 mRNA相对表达量显著增加(0.612±0.01 vs 0.092±0.05,P＜0.01),血吸虫卵处理后的肠炎组较TNBS肠炎组NOD2mRNA相对表达量显著下降(0.127±0.03 vs 0.612±0.01,P＜0.05);分析血吸虫卵组和正常组NOD2mRNA相对表达量发现两组无显著差异(0.127±0.03 vs0.092±0.05,P＞0.05)。(2) Western blowing分析显示:NOD2在正常组、TNBS肠炎组、血吸虫卵组中的相对灰度值分别为0.683±0.06、1.715±0.01、0.812±0.03;TNBS肠炎NOD2的蛋白表达量较正常组分别增加了近三倍(P＜0.01),血吸虫卵组较TNBS肠炎组下降52.8%(P＜0.01),有显著统计学差异。结论:除TOLL样受体外,NOD2/CARD15在粘膜免疫反应也发挥重要作用,血吸虫卵与NOD2间相互作用也许调节T细胞免疫反应平衡。