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背景骨质疏松(Osteoporosis,OP),是一种多重因素所导致的系统性骨代谢性疾病,多数骨质疏松患者表现为骨骼疼痛、易于骨折等特征。骨质疏松患病的主要原因是成骨细胞与破骨细胞作用的平衡被打破,其主要的特征表现为单位体积内骨组织量降低,骨形成不足,成骨分化能力减弱是骨质疏松发病的一个重要因素。神经细胞粘附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM)广泛表达于神经细胞,在神经系统中的功能研究较多。近年来发现NCAM在成骨细胞、间充质干细胞中也有表达,而其生物学意义却不完全清楚。NCAM可能参与调控干细胞分化,已有研究表明,NCAM参与维持骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向脂肪细胞分化,但是NCAM在成骨细胞分化中的作用和机制尚不清楚。本课题的目标旨在阐明NCAM对成骨细胞分化的调控作用和机制。目的1.通过成骨前体细胞(MC3T3-E1)和BMSCs确定NCAM对成骨细胞分化的影响;2.阐明NCAM对成骨细胞分化的作用是通过哪条信号通路来影响的。方法1.在正常的MC3T3-E1细胞中加入特定的成骨细胞诱导液分化0 d,3 d,7d,14 d后,检测钙沉积和NCAM的变化;2.在正常的MC3T3-E1细胞中转染NCAM沉默质粒,利用Western blot和qPCR等技术手段检测成骨细胞标志物RunX2和Osterix以及钙沉积的变化;3.细胞的培养和分化,建立NCAM敲除的BMSCs(KO细胞)进行体外的研究;4.在WT和KO细胞中加入特定的成骨细胞诱导液分化0 d,3 d,7 d,14 d后,利用Western blot和qPCR等技术手段检测成骨细胞标志物RunX2和Osterix以及钙沉积的变化;5.在对照和NCAM沉默的MC3T3-E1细胞中加入Wnt蛋白激酶特异性抑制剂XAV939和激活剂LiCl。Western blot,qPCR和茜素红染色检测RunX2和Osterix的变化和钙沉积的变化。结果1.前期的研究显示,在正常的成骨前体细胞MC3T3-E1的诱导成骨细胞分化的过程中,随着成骨细胞分化天数的增加NCAM的表达量明显上调。为了明确NCAM对成骨细胞分化的影响,我们将NCAM基因在正常的成骨前体细胞MC3T3-E1中进行沉默。结果发现NCAM沉默后成骨细胞标志物RunX2和Osterix都有明显的下调,钙沉积也显著减少,这表明NCAM沉默能明显抑制成骨细胞分化;2.为了验证NCAM对成骨分化的影响,我们利用NCAM敲除的BMSCs(KO细胞)进行体外的研究。在正常的BMSCs(WT细胞)中,同样发现随着成骨细胞分化天数的增加NCAM的表达量明显上调。当NCAM缺失后,成骨细胞的标志物RunX2和Osterix的mRNA和蛋白质表达量都明显下调,并且钙沉积明显减少。这表明,NCAM的缺失能抑制进BMSCs向成骨细胞分化;3.为了探究NCAM缺失抑制成骨细胞分化的分子机制,我们对涉及的信号通路进行了探究。结果显示NCAM缺失后β-catenenin的表达量明显降低;并且将Wnt信号通路进行抑制或激活后,发现成骨细胞的指标RunX2和Osterix具有明显的下调或上调。表明NCAM缺失而导致的抑制成骨细胞分化是通过Wnt信号通路来实现的。结论1.NCAM缺失具有抑制骨细胞分化的作用;2.Wnt通路参与NCAM调控成骨细胞分化。