体腔细胞作为刺参主要的免疫反应效应器,在抵御外界异物入侵等免疫反应中充当了关键角色。刺参具有排脏和再生的特殊免疫防御机制,排脏虽然不会导致刺参的直接死亡,但会妨碍刺参的生长发育速度,同时由于大量体腔液和体腔细胞的排出导致刺参暂时失去了主要的免疫防御屏障而更易受到病原的侵染。目前,针对刺参排脏后的研究更多的关注于消化道等内脏的再生过程及再生机制,对于排脏后体腔细胞的恢复过程知之甚少,对排脏后刺参的免疫响应及免疫防御屏障的重构机制更是鲜为人知。本文利用组织学观察、单抗示踪、造血转录因子检测和EdU细胞增殖实验等技术定位了刺参的“造血组织”,明确了体腔细胞来源;利用细胞计数、免疫酶学检测和荧光定量PCR等技术研究了刺参排脏后体腔细胞的恢复规律和排脏后的免疫反应,为解析刺参体腔细胞的发生机制和生物的免疫系统进化提供了思路,同时也为进一步研究刺参排脏后免疫防御屏障的重构机制奠定了基础。刺参的“造血组织”定位。本文利用组织切片技术,观察了刺参呼吸树、异网、波里氏囊和体腔上皮的结构特征。利用人造血转录因子GATA1抗体通过Western-blot技术发现刺参体腔细胞、呼吸树、异网和波里氏囊中分别存在两条大小为90 kDa和43 kDa的GATA1造血转录因子同系物;通过免疫荧光技术检测到体腔细胞、异网和呼吸树管腔、波里氏囊的囊壁上含有大量的GATA1阳性信号,但体腔上皮上未发现任何信号。利用抗刺参体腔细胞单抗(mAb 3F6)示踪技术发现在异网和呼吸树管腔、波里氏囊的囊壁以及体腔上皮的细胞腔隙中上都存在大量的体腔细胞阳性信号。利用细胞EdU增殖技术发现异网、呼吸树和波里氏囊上存在强烈的阳性信号,体腔上皮无增殖信号。综合上述实验结果,我们分析认为异网、呼吸树和波里氏囊是刺参的“造血组织”。刺参排脏后体腔细胞的恢复规律。刺参排脏后体腔细胞和体腔液近乎被排尽,随着内脏再生的同时,体腔液和体腔细胞也会逐步恢复。通过显微计数结果显示,刺参排脏后,体腔液容积在2 h就能恢复到排脏前水平,总体腔细胞数量在排脏后6 h到达峰值,之后下降,随后又上升,期间略有波动,但在排脏后35 d可以恢复到排脏前水平。不同类型体腔细胞数量的变化与总体腔细胞数量变化总体趋势一致,不同类型之间略有差异,实验结束时,仅有变形细胞和桑椹细胞的个数恢复到排脏前水平。DNA增殖实验显示,排脏前EdU阳性细胞在占总体腔细胞的9.5%,排脏后6 h占4.7%,在排脏后第3 d达到一个最大值,为18.6%,之后出现下降趋势。因此,我们分析认为排脏后6 h体腔细胞的快速增加可能是由于体腔细胞从水管系统迁移到体腔的结果。刺参排脏后的免疫反应。本实验室前期研究表明刺参体腔内和波里氏囊内的体腔细胞虽然种类相同,但其体腔细胞数量和不同类型体腔细胞所占比例存在较大差异;另外,在刺参排脏时波里氏囊不会被排出。本文首先对健康刺参体腔内和波里氏囊内体腔液及体腔细胞从免疫功能上进行了比较,发现这两个部位在免疫酶活力和免疫相关基因表达方面都存在较大差异。因此,本文聚焦于刺参这两个部位进一步进行了刺参排脏后早期的免疫反应研究。结果显示,刺参排脏后随时间的推移,体腔内和波里氏囊内体腔液上清中的ACP、AKP、CAT及SOD都呈现先下降后逐渐恢复的变化趋势。体腔内ACP和AKP在排脏后7 d恢复至排脏前水平,CAT和SOD在排脏后7 d不能恢复至排脏前水平;波里氏囊内ACP和AKP呈现先下降后上升再下降的趋势,在第36 h达到峰值,在排脏后第7 d未恢复至排脏前水平;CAT和SOD的酶活力在排脏后7 d呈现先上升后下降在逐渐恢复的趋势。排脏后,6个免疫基因在体腔内体腔细胞中保持一个较低的表达量。除Aj-iLys外,其他基因在排脏后第3 d都到达一个峰值。体腔中AjTLR3和AjToll的mRNA表达量在排脏后第3 d分别显著上调了1.8倍和14倍;AjAP,AjMKK3/6,AjToll和AjTLR3在波里氏囊内体腔细胞的表达量呈现先下降后上升的变化趋势,且在排脏后第7 d到达一个峰值。然而AjC3-2和Aj-iLys在排脏后5 d内都没有显著的变化差异,但在排脏后第7 d分别显著上调了15.0倍和4.45倍。以上结果表明,异网、呼吸树和波里氏囊是刺参的“造血组织”;刺参排脏后体腔细胞近乎排尽,在排脏后6 h体腔细胞数量急剧增加,之后呈现一定波动,在排脏后35 d可以恢复至排脏前水平;健康刺参体腔内和波里氏囊内体腔液中的非特异性免疫因子存在显著差异。排脏后,两个组织中的免疫反应也是不同的,其中波里氏囊内体腔液上清的酶活在恢复过程中出现一个短暂的峰值。此外,体腔内体腔细胞的免疫基因的表达峰值早于波里氏囊内体腔细胞的表达峰值。