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4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)是烟草中主要的致癌物之一,具有促进细胞凋亡的作用。本实验主要研究NNK在不同浓度和时间下对细胞形态、细胞增值、细胞凋亡、细胞周期,以及对抗氧化基因GCLC、Nrf2和凋亡基因Bax、Bcl-2表达的影响。在前期动物毒理实验的基础上,以中国仓鼠肺细胞(V79)和小鼠肝细胞(NCTC 1469)为研究对象,运用细胞形态学,MTT法、Hoechst33258染色,流式细胞仪、荧光定量PCR等方法,研究不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/m L)和不同胁迫时间(12、24、36h)下,NNK对细胞的胁迫作用,主要以细胞及其细胞核形态的变化,细胞凋亡和细胞周期的变化,并以相关基因(GCLC、Nrf2、Bax、Bcl-2)在NNK诱导下所产生的调控变化为检测指标,其结果如下:1、NNK能导致细胞形态发生改变。对照组细胞贴壁生长,排列均匀,大小基本一致,轮廓清晰,悬浮细胞少。在实验组中,随NNK浓度上升,细胞出现皱缩,细胞数量及生长密度逐渐减少,细胞颗粒增多。2、MTT结果显示:相同胁迫时间下,NNK对两种细胞增殖的抑制均随NNK浓度的增加而升高,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),存在明显的剂量-效应关系。3、Hochest33258染色结果显示:NNK胁迫细胞24h后,与正常细胞相比,细胞核均出现不同程度蓝色荧光,可见核致密、浓染等典型的凋亡形态学特征。4、流式细胞仪检测结果显示:细胞凋亡率随NNK浓度的升高而增大;且能将细胞周期阻滞在G0/G1期。5、荧光定量PCR结果显示:经NNK胁迫后,两种细胞中GCLC、Nrf2、Bax表达均上调,Bcl-2表达明显下调;其表达变化与这些基因的作用机理相一致。由以上结果可得出:NNK能明显抑制V79和NCTC 1469细胞增殖,存在正向的剂量-效应关系;NNK对V79和NCTC 1469有促凋亡作用;NNK可使V79和NCTC 1469的细胞周期阻滞在G0/G1期;NNK可使V79和NCTC 1469的GCLC、Nrf2、Bax表达上调,Bcl-2表达下调。