冠心病被称为人类健康和生命的“第一大杀手”,在全球的发病率和病死率都呈逐年上升的趋势。而治疗冠心病除了传统的药物治疗之外,冠状动脉溶栓、经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植术也在治疗中广泛应用,优点是能开通闭塞和狭窄的血管,恢复冠脉血流,但也不可避免的带来血管开通后心肌缺血再灌注损伤,这已经成为目前对冠心病研究的一个热点问题。冠状动脉闭塞会导致心脏缺血,会明显的影响到心肌细胞供血供氧而产生一定的损害。而心肌细胞缺血后恢复供血会导致活性氧簇(ROS)而产生进一步的损害,影响了心肌细胞的功能,即心肌的缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。I/R损伤过程中伴随着许多不良反应,如严重的缺氧、酸中毒、钙超载、能量耗竭和离子动态平衡紊乱等,在这些因素的影响下,心肌受到损伤而最终导致心肌细胞死亡。线粒体可以为心肌细胞的活动提供能量支持,在I/R损伤的作用很重要,线粒体在受损情况下产生的活性氧明显高于正常条件下的,而活性氧对线粒体蛋白质和DNA会产生很强损伤作用,这也导致线粒体被破坏,进而对细胞造成损伤。适度的线粒体自噬可以对一些受损线粒体起到清除作用,降低了这种损害,因而适当调控线粒体自噬可以减轻心肌的缺血再灌注损伤。相关研究发现细胞自噬调节路径有很多种,包括调节线粒体去极化的PINK1(PTEN induced putative kinase 1)/Parkin(Parkinson juvenile disease protein 2)途径,线粒体自噬受体分子FUNDC1(FUN14 domain containing 1)介导的线粒体自噬途径,还有一种途径就是本课题着重研究的BNIP3通路在缺血缺氧下介导的自噬途径。BNIP3(Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein 3)属于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亚家族成员,主要分布于内质网(ER),松散的结合在线粒体外膜上,其在细胞内的位置决定细胞死亡方式。BNIP3通过其BH3结构域开放线粒体通透性转换孔(m PTP)从而影响到线粒体功能,在此基础上促使细胞凋亡;实验研究还发现其BH3结构域导致Bcl-2/Beclin-1作用受影响而启动自噬机制,Beclin-1表达增强可以作为自噬水平升高的重要指标。当细胞的营养和氧减少时,BNIP3可以激活线粒体自噬,在不改变线粒体通透性和不依赖于凋亡的前提下,介导线粒体自噬。适度的线粒体自噬可以消除受损的线粒体,维持机体内环境的稳定。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是一种异源二聚体,其主要组成包括亚基HIF-lα和HIF-1β。HIF-lα在正常氧条件下稳定性差,受到脯氨酰羟化酶催化而羟基化后,容易结合肿瘤抑制蛋白(VHL),被识别成泛素化的部位,之后通过泛素-蛋白酶体通路被迅速降解。此降解过程在缺氧条件下受到抑制;HIF-lα转移到细胞核内结合HIF-1β而组合成复合体,所得产物结合低氧反应元件(HRE),且对超60个靶基因的转录进行介导。既往在肿瘤细胞,肝脏和肾脏细胞缺血再灌注损伤研究发现,线粒体自噬介导的选择性自噬会导致线粒体破坏并释放,而HIF-1α在线粒体自噬过程中起着重要调节作用。许多研究表明由HIF-1α引起的BNIP3和BNIP3L的表达上调在低氧诱发的自噬密切相关。本研究分别以SD大鼠、H9C2心肌细胞和急性心肌梗死患者的外周血为研究对象。分别应用酶联免疫吸附法(ELISA法)、实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白印迹法(Western Blot)、MTS实验、LDH实验和透射电镜等实验方法研究心肌缺血再灌注损伤情况下HIF-1α和BNIP3的表达;然后通过体外实验研究升高或敲低BNIP3后对H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤情况下的细胞活力和LDH释放、细胞自噬水平的影响,最后通过检测相关通路蛋白的表达情况进一步探讨其影响心肌氧糖剥夺再灌注损伤的途径,阐明了HIF-1α/BNIP3信号通路在心肌氧糖剥夺再灌注损伤的作用,从而为更深刻的认识心肌氧糖剥夺再灌注损伤发生发展的分子机制。第一部分SD大鼠心肌缺血再灌注损伤时HIF-1α和BNIP3的表达目的:验证HIF-1α和BNIP3蛋白水平在SD大鼠心肌细胞缺血再灌注中的表达。方法:1.SD大鼠随机分为4组,每组12只,分别为:假手术(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+DMOG组(I/R+DMOG组)、缺血再灌注+3-MA组(I/R+3-MA组);2.TTC和HE染色法检测SD大鼠心肌缺血的面积和心肌细胞的损伤水平;3.Western Blot法检测各组心肌组织中HIF-1α、BNIP3、LC3-I、LC3-II、Beclin-1蛋白表达水平;结果:1.SD大鼠各组心肌组织TTC结果显示:DMOG预处理能够显著减轻大鼠I/R损伤的心肌梗死面积,而3-MA预处理组能显著增加心肌梗死面积。2.SD大鼠各组心肌组织HE染色结果显示:DMOG预处理能显著减轻SD大鼠I/R的心肌损伤,而3-MA预处理加重SD大鼠I/R的心肌损伤。3.DMOG预处理可通过上调HIF-1α的水平使BNIP3的表达水平和自噬调节蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-1的表达水平增高,激活心肌细胞的自噬起保护心肌的作用;3-MA预处理通过抑制自噬,使自噬调节蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-1表达降低,加重了心肌损伤。小结:1.HIF-1α和BNIP3蛋白水平在SD大鼠心肌I/R损伤情况下中表达显著增高;HIF-1α的激动剂DMOG能升高HIF-1α的水平,进而升高BNIP3蛋白及自噬调节蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-1的水平。2.升高HIF-1α和BNIP3蛋白水平,会使自噬水平增高,进一步减轻SD大鼠心肌细胞I/R损伤,抑制自噬水平会加重SD大鼠心肌细胞I/R损伤。第二部分HIF-1α对BNIP3调节在H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤中的作用目的:研究升高和敲低BNIP3对氧糖剥夺再灌注损伤状态下H9C2心肌细胞细胞活力和细胞损伤的影响。方法:1.H9C2细胞氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型的建立,将H9C2细胞随机分为6组,control组、OGD/R(24h/2h)组、OGD/R(24h/2h)+DMOG组、OGD/R(24h/2h)+YC-1组、OGD/R(24h/2h)+Tre组、OGD/R(24h/2h)+BNIP3-si RNA组;2.免疫化学染色及Western Blot法检测各组HIF-1α及BNIP3的表达;3.MTS实验和LDH实验检测升高和转染技术敲低BNIP3对H9C2细胞在氧糖剥夺再灌注损伤中细胞活力和损伤的影响;结果:1.成功构建升高和抑制HIF-1α蛋白表达水平的H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤模型。2.升高BNIP3蛋白表达水平会使H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤中LDH释放降低,敲低BNIP3蛋白表达水平会使H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤中LDH释放升高。3.升高BNIP3蛋白表达水平会提高H9C2细胞在氧糖剥夺再灌注损伤中活力,敲低BNIP3蛋白表达水平会降低H9C2细胞在氧糖剥夺再灌注损伤中活力。小结:1.在H9C2细胞OGD/R损伤中升高HIF-1α水平会使BNIP3蛋白水平同步升高,降低HIF-1α水平会使BNIP3蛋白水平同步降低。2.升高BNIP3蛋白水平会减轻H9C2细胞OGD/R损伤,敲低BNIP3蛋白表达会加重H9C2细胞OGD/R损伤。第三部分BNIP3通过激活线粒体自噬减轻H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤目的:进一步研究BNIP3在H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤过程中对心肌细胞自噬的影响。方法:1.H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型的建立,将H9C2心肌细胞随机分为5组,control组、OGD/R(24h/2h)组、OGD/R+Tre(24h/2h)组、OGD/R(24h/2h)+BNIP3-si RNA组、OGD/R(24h/2h)+3-MA组;2.Western Blot法检测升高和转染技术敲低BNIP3及抑制线粒体自噬,BNIP3和自噬蛋白的表达。3.通过透射电镜观察H9C2心肌细胞在不同干预条件下的自噬水平。结果:1.升高BNIP3蛋白会增加H9C2心肌细胞在OGD/R损伤中自噬水平,敲低BNIP3蛋白会降低H9C2心肌细胞在OGD/R损伤中自噬水平。2.进一步应用透射电镜验证升高BNIP3蛋白会增加H9C2心肌细胞在OGD/R中的自噬,敲低BNIP3蛋白会降低H9C2心肌细胞在OGD/R中的自噬;抑制H9C2心肌细胞自噬会增加H9C2心肌细胞OGD/R损伤,适度的增加H9C2心肌细胞自噬会减轻OGD/R损伤。小结:1.升高BNIP3蛋白的表达水平会提高H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤中自噬水平,从而减轻H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤。2.敲低BNIP3蛋白的表达水平会降低H9C2心肌细胞的自噬水平,从而加重H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤。第四部分急性心肌梗死患者血清HIF-1α的表达目的:验证HIF-1α水平在急性ST段抬高型心肌梗死的患者中表达。方法:1.应用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测36例急性ST段抬高型心肌梗死(Acute ST-Segment Elevation Myocardial Infarction,STEMI)的并行经皮冠状动脉介入治疗术(Percutaneous coronary intervention,PCI)术患者、32例急性ST段抬高型心肌梗死行冠脉造影(Coronary arteriography,CAG)术患者、35例无冠心病对照组(NC)的血清HIF-1α表达水平。结果:1.三组受试者的临床资料特征无统计学差异。2.与NC组相比HIF-1α外周血清水平在STEMI+PCI组和STEMI+CAG组血清中表达上调,且STEMI+PCI组的HIF-1α水平升高的更显著。小结:急性ST段抬高型心肌梗死患者,开通冠脉血流恢复后的外周血血清HIF-1α水平会升高。