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研究背景：细胞防御的一个重要机制就是Keap1-Nrf2信号通路的激活。生理状态下,Keap1 (Kelch-like ECH-associated proteinl)作为Cul3依赖性E3 (ubiquitin-protein ligase)泛素连接酶复合物的衔接蛋白,介导转录因子Nrf2 (NF-E2-related factor 2)泛素化,被26S蛋白酶体降解。在应激或伤害条件下,Nr-2与Keap1解偶联并转入细胞核内,调节其下游靶基因表达。因此,胞质蛋白Keap1对于Nrf2的激活具有重要意义。催化蛋白去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)被认为可能是治疗许多人类疾病的有用靶点,包括中枢神经系统疾病。研究表明,HDAC抑制剂能够通过激活lKeap1-Nrf2通路,发挥神经保护作用,但是对其激活机制目前尚未完全阐明。本研究旨在探讨在RAW 264.7细胞中,HDAC抑制剂TSA调控Keap1-Nrf2信号通路的可能作用机制。研究目的：1、确认TSA可以激活Keap1-Nrf2通路；2、构建真核重组质粒pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-624), pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-314)和pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(315-624),研究TSA作用于Keap1的可能功能片段；3、研究TSA是否能够通过蛋白水平调控Keap1。若能,则进一步探讨TSA促进Keap1蛋白降解的可能途径。研究方法：1、培养RAW 264.7细胞,利用不同浓度的TSA(10ng/ml,30ng/ml, 100ng/ml)处理细胞16h, Western Blot法检钡Keap1、 Nrf2、 HO1和NQO1蛋白表达水平；RT-PCR法检钡Keap1 mRNA表达水平；2、培养RAW 264.7细胞,利用一定浓度的TSA(30ng/ml)处理细胞4h,免疫荧光法检测Nrf2的核易位情况。3、利用限制性内切酶和DNA测序对构建的重组质粒进行鉴定；4、培养RAw 264.7细胞,TSA(30ng/ml)和ActD(0.5ug/ml)共处理细胞12h, Western Blot检测]Keap1蛋白表达情况,RT-PCR检钡Keapl mRNA表达情况；5.Lipo 2000转染RAW264.7细胞,TSA (30ng/ml)处理16h,收集转染48h的蛋白,外源性Keap1蛋白表达水平利用Western Blot法检测；6、培养RAW 264.7细胞,TSA (30ng/ml)和MG-132(5umol/L)/3-MA (5mmol/L)共处理细胞12h,免疫印迹法检钡Keap1蛋白表达水平。研究结果：1、TSA抑制内源性Keap1蛋白和mRNA表达水平,且这种抑制作用具有剂量和时间依赖性；2、TSA促-Nrf2核易位,同时上调其下游蛋白表达；3、重组质粒经过酶切鉴定和DNA序列比对,证实构建成功；4、TSA和ActD共处理后,Keap1蛋白表达明显减少,而Keap1 mRNA水平无明显变化；5、TSA促进外源性Keap1蛋白降解；6、蛋白酶抑制剂MG-132和自噬抑制剂3-MA不影响TSA对Keap1蛋白的降解。结论：HDAC抑制剂TSA能够抑制Keap1表达,激活Nrt2,引发下游反应。TSA不仅可以通过转录水平抑制Keap1表达,还能从蛋白水平抑制其表达,即TSA可以直接促进Keap1蛋白降解,而导致Keap1蛋白降解的途径有可能不依赖蛋白酶体途径和溶酶体途径,详细机制仍有待进一步研究。