本研究主要以C57BL/6N小鼠为研究对象,运用CRISPR-Cas9技术进行白化C57BL/6N小鼠的制作以及利用死亡小鼠精子恢复转基因品系。为获得白化C57BL/6N小鼠,利用CRISPR-Cas9技术,设计合成Cas9 mRNA和系列sgRNA,注射到受精卵,破坏合成C57BL/6N小鼠的酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因,产生基因突变小鼠,经重复回交和自交,形成C57BL/6N白化小鼠近交系。结果经注射两对sgRNA,成功获得了F0代白化小鼠,在Tyr基因的第1和第2外显子中均发生了缺失突变,其中第1外显子缺失45 bp和14 bp,第2外显子缺失7 bp和3 bp。小鼠可将突变基因传递给后代,并在其后代中产生了纯合白色C57BL/6N小鼠,成功地建立了C57BL/6N白化小鼠近交系,为将来嵌合体制作,组织移植提供了新的研究工具。为探究死亡转基因小鼠品系精子是否具有激活卵母细胞并使胚胎继续发育至小鼠出生的能力,利用卵胞质内单精注射(ICSI)技术,将Nestin-GFP转基因雄鼠死后14 h,24 h,48 h的精子分别注射进C57BL/6N和B6D2F1小鼠卵母细胞中,发育至2细胞后移植入代孕受体,对部分B6D2F1来源胚胎进行体外观察培养,同时运用免疫荧光技术对B6D2F1胚胎雄原核进行组蛋白H2AX磷酸化检测。结果发现:三个实验组的死亡精子均能激活并使C57BL/6N和B6D2F1卵母细胞受精,2-cell胚胎移植后成功获得F0代小鼠,且F0代小鼠有正常繁殖能力,顺利获得F1代小鼠,同时转基因特点得以保留并遗传下去。B6D2F1来源的ICSI胚胎体外发育,三个实验组卵裂率、囊胚率均显著低于对照组(0 h)。B6D2F1来源的ICSI胚胎,24 h和48 h出生率均显著低于14 h组和对照组(0 h)。C57BL/6N来源ICSI胚胎,24 h和48 h卵裂率均显著低于14 h组和对照组(0 h),三个实验组出生率均显著低于对照组(0 h)。组蛋白H2AX的磷酸化检测结果显示,三个实验组无焦点胚胎比例均极显著低于对照组(0 h);48 h无焦点胚胎比例极显著低于14 h和24 h;经秩和检验,三个实验组的焦点数均极显著高于对照组(0 h)。综上,利用ICSI技术,小鼠死后14 h,24 h,48 h的精子具备激活卵母细胞并使胚胎继续发育至小鼠出生的能力。本研究为挽救意外死亡转基因小鼠品系提供了一种有效途径。