水稻纹枯病菌及稻曲病菌LAMP检测体系的建立与应用

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:geweiqi0219
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
水稻纹枯病和稻曲病是水稻生长过程中严重影响水稻产量和质量的两大重要病害,随着施肥水平的提高和种植制度的多样化,水稻纹枯病和稻曲病的发生日趋严重。本研究利用分子鉴定的方法明确了中国东北主要稻区水稻纹枯病病原菌种类及融合群的归属情况,并分别建立了水稻纹枯病优势致病菌茄丝核菌(Rhizoctomia solani AG1-IA)及稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测体系,实现了两种病原菌的田间快速检测。具体研究结果如下:东北三省水稻纹枯病原菌种类及融合群的分子鉴定:2015-2017年从黑龙江省、吉林省和辽宁省的17个水稻主产区采集水稻纹枯病病样,分离得到水稻纹枯病菌214株,运用不同病原菌及融合群的特异性引物对214株水稻纹枯病菌进行病原菌种类和融合群鉴定,并利用r DNA内转录间隔区(ITS)序列分析法,对供试水稻丝核菌的融合群归属进行了分析。结果表明:供试214株水稻纹枯病菌分属于茄丝核菌(Rhizoctonia solani)和水稻丝核菌(Rhizoctonia oryzae-sativae),菌株数分别为198株和16株,占比分别为92.52%和7.48%。茄丝核菌菌株分属于2个融合群,分别为AG1-1A和AG4,菌株数分别为191株和7株,占比分别为96.46%和3.54%。水稻丝核菌菌株均属于AG-Bb,菌株数为16株。不同年份水稻纹枯病的病原菌种类及融合群出现的频率和地域分布无明显变化,而不同地域间水稻纹枯病病原菌的种类及融合群具有明显的分化特征,AG1-IA融合群在中国东北三省各个水稻产区均有分布且均为优势融合群,AG4融合群在辽宁省盘锦市出现频率最高,水稻丝核菌AG-Bb融合群在吉林省吉林市、通化市和梅河口市出现频率最高。水稻纹枯病菌(Rhizoctomia solani AG1-IA)LAMP检测体系的建立及应用:本研究以水稻纹枯病菌(Rhizoctomia solani AG1-IA)r DNA-ITS为靶标基因序列,基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,设计了4条特异性的LAMP引物和1条环引物,建立了一种基于羟基萘酚蓝(HNB)显色的RS-ITS-LAMP快速检测体系,并对反应温度、时间及反应体系中的6个主要因素进行优化测试,确定最佳反应条件为64℃恒温扩增60 min,最佳反应体系为:10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、MgSO4(6 mmol/L)1.5μL、甜菜碱(1.4 mol/L)3.5μL、d NTPs(1.8 mmol/L)4.5μL、外引物RS-F3/B3(0.2μmol/L)0.5μL、内引物RS-FIP/BIP(1.0μmol/L)2.5μL、环引物RS-LB(0.4μmol/L)1μL、Bst DNA聚合酶(0.32 U/μL)1μL、DNA模板1μL、HNB(192μmol/L)2μL、dd H2O补齐至25μL。特异性验证结果表明:羟基萘酚蓝特异性显色反应中,水稻纹枯病菌Rhizoctomia solani AG1-IA菌株DNA扩增后反应液均呈现天蓝色阳性反应,而其他土壤习居菌、水稻常见其他病害病原菌和其他病害病原菌的供试菌株DNA扩增后反应液均呈紫罗兰色阴性反应,引物特异性良好。灵敏度试验结果表明:RS-ITS-LAMP技术最低检测限为1 pg·μL(-1)的菌株纯DNA,比常规PCR技术高出两个数量级,具有较高灵敏度。该检测体系应用结果显示,人工添加菌丝的土壤带菌检测灵敏度为0.5μg/g,且人工接种发病植株病部、田间发病植株病部及田间土壤带菌检测结果均呈阳性。稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)LAMP检测体系的建立及应用:以稻曲病菌翻译延伸因子(Translation elongation factor 1α,tef1α)为靶标基因序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,建立了一种基于SYBR Green I颜色判定的简单、快速和灵敏的UV-tef-LAMP检测体系,对反应温度、时间和反应体系中的6个主要因素进行优化测试,确定最佳反应条件为65℃恒温扩增60 min;最佳反应体系:10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、MgSO4(6 mmol/L)1.5μL、甜菜碱(1.2 mol/L)3μL、d NTPs(1.4 mmol/L)3.5μL、外引物UV-F3/B3(0.2μmol/L)0.5μL、内引物UV-FIP/BIP(1.0μmol/L)2.5μL、环引物UV-LF/LB(0.6μmol/L)1.5μL、Bst DNA聚合酶(0.32 U/μL)1μL、DNA模板1μL、dd H2O补齐至25μL,反应结束后加入0.25μL的SYBR Green I。特异性验证结果表明:不同地理来源的稻曲病菌菌株DNA扩增反应液加入SYBR Green I后均呈现黄绿色阳性反应,而其他土壤习居菌、水稻常见其他病害病原菌和其他病害病原菌的供试菌株DNA扩增反应液加入SYBR Green I后均呈现橙色阴性反应,引物特异性良好。在灵敏度试验中,UV-tef-LAMP技术最低检测限为100 fg·μL(-1)的菌株纯DNA,具有较高灵敏度。该检测体系应用结果显示,人工添加稻曲病菌分生孢子的土壤灵敏度检测:能够在每250 mg土壤含10个分生孢子的情况下检出该病菌,检出率较高。人工添加稻曲病菌厚垣孢子粉的土壤灵敏度检测限为0.4μg/g。田间不同发病形态的稻曲穗(粒)检测均呈阳性,田间土壤样品也可检出稻曲病菌。
其他文献
冷链物流作为果蔬农产品的主要流通方式,经过我国多年以来的研究发展,现已得到越来越多的应用。其中最关键的问题在于“最先一公里”及“最后一公里”,预冷就是解决“最先一
烟草脉坏死病是由马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVYN)侵染引起的,导致烟草产量及质量显著降低,严重时烟叶失去烘烤价值、经济损失严重。近年来通过矿
金属有机框架(Metal Organic Frameworks,MOFs)是由金属离子或金属团簇与有机配体构成的配位化合物,由于其较大的比表面积、结构的多样性和可调整的孔道,在吸附和分离、传感
目的探讨经血间充质干细胞(MenSCs)移植改善化疗所致卵巢早衰小鼠卵巢功能的效果和分子机制。方法48只C57BJ雌鼠被随机分成3组:对照组、POF组和干细胞组。环磷酰胺和白消安腹腔注射构建POF小鼠;干细胞组小鼠在化疗药物注射后3d开始鼠尾静脉注射MenSCs。通过检测血清性激素水平、超排卵子数、卵巢湿重评估卵巢功能;采用qRT-PCR定量分析卵巢内生长因子受体结合蛋白10(GRB10)、胰岛素
“十三五”期间,我国核电发展面临难得的历史机遇,核电安全是首要解决的问题。核电的安全发展取决于工艺和设备的安全,而设备安全运行的关键是保证其结构完整性。疲劳和断裂评定是核电设备结构完整性研究工作中最重要的两个环节,两者相互依存,相互影响。随着核电设备国产化的推进,核电材料也正在大规模的实施国产化,国产SA508 Gr.3 Cl.2是CAP1400核电装置中蒸汽发生器、稳压器、非能动余热排出热交换器
以自制的SSOS(辛烯基琥珀酸淀粉酯)为壁材,以易挥发性的农药氯化苦为芯材,采用喷雾干燥的技术制备微胶囊。通过单因素实验和响应面实验优化其工艺条件,得到体系pH值为9,温度
为进一步探索环境(食物)对果蝇生殖选择的影响,即验证本组前期工作中发现的果蝇Est-6酯酶基因射精管调节区(Ejaculatory duct regulatory region,EDRR)局部缺失对果蝇交配行为的影响,本实验以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)为研究对象,采用SLIC无缝克隆技术对腺相关病毒载体PAAV-ALSTR-IRES-EGFP进行重组改造,构建出PA
气动调节阀被应用到工业的诸多领域,是工业生产过程中重要的执行部件,智能阀门定位器是使调节阀拥有良好的控制精度、提高阀门响应速度的良好保证。国产的阀门定位器在控制效果上与国外产品有较大的差距,各项性能指标上都还有很大的提升空间。国内对智能阀门定位器控制算法的研究还不深刻,其中主要在于对调节阀模型的研究还不够深刻,很少有研究分析阀门定位器控制算法与阀门定位器非线性特性之间的联系。本文在分析阀门定位器核
LED具有长寿命、节能、无汞环保、光品质高等优势,被称为21世纪的第四代照明光源,而应用于照明的白光LED通常为荧光转换型LED(pc-LED),即其发光来源自LED芯片以及荧光粉。市场
目的探讨急性心肌梗死后左心室壁瘤(Post-infarction left ventricular aneurysm,PI-LVA)患者并发快速室性心律心律失常的危险因素与预后分析。方法回顾性调查我院2016年1月-2019年1月间收治的PI-LVA患者147例,根据资料确定是否合并快速室性心律失常(ventricular tachyarrhythmias,VTA)分为VTA组(42例)与no-V