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水稻纹枯病和稻曲病是水稻生长过程中严重影响水稻产量和质量的两大重要病害,随着施肥水平的提高和种植制度的多样化,水稻纹枯病和稻曲病的发生日趋严重。本研究利用分子鉴定的方法明确了中国东北主要稻区水稻纹枯病病原菌种类及融合群的归属情况,并分别建立了水稻纹枯病优势致病菌茄丝核菌(Rhizoctomia solani AG1-IA)及稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测体系,实现了两种病原菌的田间快速检测。具体研究结果如下:东北三省水稻纹枯病原菌种类及融合群的分子鉴定:2015-2017年从黑龙江省、吉林省和辽宁省的17个水稻主产区采集水稻纹枯病病样,分离得到水稻纹枯病菌214株,运用不同病原菌及融合群的特异性引物对214株水稻纹枯病菌进行病原菌种类和融合群鉴定,并利用r DNA内转录间隔区(ITS)序列分析法,对供试水稻丝核菌的融合群归属进行了分析。结果表明:供试214株水稻纹枯病菌分属于茄丝核菌(Rhizoctonia solani)和水稻丝核菌(Rhizoctonia oryzae-sativae),菌株数分别为198株和16株,占比分别为92.52%和7.48%。茄丝核菌菌株分属于2个融合群,分别为AG1-1A和AG4,菌株数分别为191株和7株,占比分别为96.46%和3.54%。水稻丝核菌菌株均属于AG-Bb,菌株数为16株。不同年份水稻纹枯病的病原菌种类及融合群出现的频率和地域分布无明显变化,而不同地域间水稻纹枯病病原菌的种类及融合群具有明显的分化特征,AG1-IA融合群在中国东北三省各个水稻产区均有分布且均为优势融合群,AG4融合群在辽宁省盘锦市出现频率最高,水稻丝核菌AG-Bb融合群在吉林省吉林市、通化市和梅河口市出现频率最高。水稻纹枯病菌(Rhizoctomia solani AG1-IA)LAMP检测体系的建立及应用:本研究以水稻纹枯病菌(Rhizoctomia solani AG1-IA)r DNA-ITS为靶标基因序列,基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,设计了4条特异性的LAMP引物和1条环引物,建立了一种基于羟基萘酚蓝(HNB)显色的RS-ITS-LAMP快速检测体系,并对反应温度、时间及反应体系中的6个主要因素进行优化测试,确定最佳反应条件为64℃恒温扩增60 min,最佳反应体系为:10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、MgSO4(6 mmol/L)1.5μL、甜菜碱(1.4 mol/L)3.5μL、d NTPs(1.8 mmol/L)4.5μL、外引物RS-F3/B3(0.2μmol/L)0.5μL、内引物RS-FIP/BIP(1.0μmol/L)2.5μL、环引物RS-LB(0.4μmol/L)1μL、Bst DNA聚合酶(0.32 U/μL)1μL、DNA模板1μL、HNB(192μmol/L)2μL、dd H2O补齐至25μL。特异性验证结果表明:羟基萘酚蓝特异性显色反应中,水稻纹枯病菌Rhizoctomia solani AG1-IA菌株DNA扩增后反应液均呈现天蓝色阳性反应,而其他土壤习居菌、水稻常见其他病害病原菌和其他病害病原菌的供试菌株DNA扩增后反应液均呈紫罗兰色阴性反应,引物特异性良好。灵敏度试验结果表明:RS-ITS-LAMP技术最低检测限为1 pg·μL(-1)的菌株纯DNA,比常规PCR技术高出两个数量级,具有较高灵敏度。该检测体系应用结果显示,人工添加菌丝的土壤带菌检测灵敏度为0.5μg/g,且人工接种发病植株病部、田间发病植株病部及田间土壤带菌检测结果均呈阳性。稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)LAMP检测体系的建立及应用:以稻曲病菌翻译延伸因子(Translation elongation factor 1α,tef1α)为靶标基因序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,建立了一种基于SYBR Green I颜色判定的简单、快速和灵敏的UV-tef-LAMP检测体系,对反应温度、时间和反应体系中的6个主要因素进行优化测试,确定最佳反应条件为65℃恒温扩增60 min;最佳反应体系:10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL、MgSO4(6 mmol/L)1.5μL、甜菜碱(1.2 mol/L)3μL、d NTPs(1.4 mmol/L)3.5μL、外引物UV-F3/B3(0.2μmol/L)0.5μL、内引物UV-FIP/BIP(1.0μmol/L)2.5μL、环引物UV-LF/LB(0.6μmol/L)1.5μL、Bst DNA聚合酶(0.32 U/μL)1μL、DNA模板1μL、dd H2O补齐至25μL,反应结束后加入0.25μL的SYBR Green I。特异性验证结果表明:不同地理来源的稻曲病菌菌株DNA扩增反应液加入SYBR Green I后均呈现黄绿色阳性反应,而其他土壤习居菌、水稻常见其他病害病原菌和其他病害病原菌的供试菌株DNA扩增反应液加入SYBR Green I后均呈现橙色阴性反应,引物特异性良好。在灵敏度试验中,UV-tef-LAMP技术最低检测限为100 fg·μL(-1)的菌株纯DNA,具有较高灵敏度。该检测体系应用结果显示,人工添加稻曲病菌分生孢子的土壤灵敏度检测:能够在每250 mg土壤含10个分生孢子的情况下检出该病菌,检出率较高。人工添加稻曲病菌厚垣孢子粉的土壤灵敏度检测限为0.4μg/g。田间不同发病形态的稻曲穗(粒)检测均呈阳性,田间土壤样品也可检出稻曲病菌。