第一部分 SUMO-rhFGF19融合蛋白在Ni亲和层析柱上的同步复性与纯化，及其活性检测　　目的:重组人成纤维细胞生长因子19(rhFGF19)能调控糖脂代谢和胆汁酸代谢，具有重要的潜在临床应用价值。然而，以大肠杆菌为载体实现高水平表达时，rhFGF19以无生物活性的包涵体形式存在，需要经过繁琐且耗时的液相透析复性才能得到活性蛋白。本研究拟表达SUMO-rhFGF19并利用融合蛋白中SUMO标签与Ni亲和层析柱特异性亲和的特性，开展融合蛋白固相复性。复性成功后用SUMO蛋白酶特异性切除N端SUMO标签从而获得具有生物活性的rhFGF19。本研究中的固相复性既为获得高产量高纯度的rhFGF19提供了新方法，也为其他非可溶性表达蛋白的复性提供了参考。　　方法:选用BL21(DE3)感受态细胞转染SUMO-rhFGF19融合蛋白质粒，培养菌体至OD600约为0.8～1.2，加入1 mM IPTG诱导表达4小时。收集菌体，用裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8.0，10％(V/V)甘油，150 mM NaCl）重悬冰浴破碎，高速离心收集上清和沉淀部分（包涵体蛋白），将包涵体用变性缓冲液(25 mM Tris-HCl，pH8.0，6M脲，50 mMβ-巯基乙醇，150 mM NaCl)室温溶解2小时，后在4℃，20000 rpm条件下离心30分钟，除去不溶物。最后选用0.22μm滤膜过滤变性蛋白，稀释至特定浓度后进行柱上复性。　　研究变性蛋白浓度对复性效率和生物学活性的影响:将蛋白稀释至1/2.5/7.5mg/mL，分别上样至预先用10个柱体积(CVs)变性缓冲液A平衡过的Ni亲和层析柱中，后用变性缓冲液A以2 mL/min继续平衡柱子至5 CVs。接着按照0.1mL/min流速用复性缓冲液(25 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl，0.5M尿素，1 mM GSSG，5mMGSH)置换变性缓冲液(Buffer B:0～100％; Buffer A:100％～0)，柱上复性12h。复性结束后以1.0 mL/min流速，用平衡缓冲液(25 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl)和洗脱缓冲液(25 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl，1 M imidazole)梯度(Buffer D:0～100％; Buffer C:100％～0)洗脱约10 CVs。　　研究复性时间对复性效率和生物学活性的影响:将蛋白稀释至1 mg/mL，分别注射至预先用10个柱体积(CVs)变性缓冲液A平衡过的Ni亲和层析柱中，后用变性缓冲液A以2 mL/min，继续平衡柱子5CVs。接着按照0.1 mL/min流速用复性缓冲液B置换变性缓冲液A(Buffer B:0～100％; Buffer A:100％～0)，分别柱上复性4/8/12 h，并按上述方法进行洗脱。　　1 mg/mL的复性蛋白与SUMO蛋白酶以1∶10比例混合孵育，4℃酶切16h。酶切蛋白混合液用Ni亲和层析柱纯化，SUMO，SUMO-rhFGF19以及SUMO蛋白酶会与Ni亲和层析柱结合，酶切获得的rhFGF19则在柱子流穿液中。选用rhFGF19单克隆抗体检验所获目标蛋白。　　体外生物学活性检测，选用HepG2细胞给药rhFGF190/0.4/2/10μg/mL刺激30分钟，Western blotting检测p-ERK1/2变化情况。体内生物学活性检测，选用野生型C57BL/6小鼠尾静脉注射0/10/100μg rhFGF19，给药两小时后取肝脏组织，用Trizol法提取总RNA，后Sybrgreen荧光标记的RT-PCR测定Cyp7α1表达量。　　结果:SUMO-rhFGF19融合蛋白实现了高水平表达，但结果表明融合蛋白仍以包涵体形式存在。选用Ni亲和层析柱成功复性并纯化获得SUMO-rhFGF19融合蛋白，进一步利用SUMO蛋白酶特异性酶切获得了rhFGF19。体外HepG2细胞实验证明，所获得rhFGF19能有效激活细胞ERK1/2通路，增加p-ERK1/2水平。小鼠体内给药rhFGF19能有效抑制肝Cyp7α1 mRNA水平，并呈现剂量依赖性。体内活性检测结果证明本法所获得的rhFGF19具有生物学活性。　　结论:本研究提出了利用Ni亲和层析柱进行SUMO-rhFGF19融合蛋白复性和纯化的新工艺。Westem blotting检测和细胞实验分析证实该方法成功一步实现了蛋白的复性与纯化。研究也证实变性蛋白浓度对利用Ni亲和层析柱进行柱上复性影响极小，而脲浓度梯度改变较缓复性时间较长则更能促进蛋白复性。　　第二部分 SUMO-rhFGF20融合蛋白的表达，纯化及活性测定研究　　目的:重组人成纤维细胞生长因子20(rhFGF20)可以抑制多巴胺能神经元的凋亡，具有对帕金森病等神经疾病潜在的治疗价值。然而，与rhFGF19一样，rhFGF20在大肠杆菌中以包涵体形式表达，需要步骤繁琐且耗时长久的透析复性才能得到很少的活性蛋白，这大大影响了对其研究的推进。本研究拟通过构建了SUMO-rhFGF20融合蛋白，来实现FGF20蛋白高效可溶性表达，进而大大简化rhFGF20的蛋白表达与纯化步骤。　　方法:选用BL21(DE3)感受态细胞转染SUMO-rhFGF20融合蛋白质粒，20℃培养菌体至OD600约为0.8～1.2，加入1mM IPTG诱导表达16小时。收集菌体，用裂解缓冲液(25 mM Tris-HCl，pH8.0，10％(V/V)甘油，150 mM NaCl）重悬冰浴破碎，高速离心收集上清和沉淀部分。用0.22μm滤膜过滤上清可溶性蛋白，用结合缓冲液A(25 mMTris-HCl，pH8.0，150 mM NaCl，50 mM Imidazole)稀释5倍过Ni亲和层析柱。所得SUMO-rhFGF20蛋白与SUMO蛋白酶以1∶10比例混合孵育，4℃酶切16h。酶切蛋白混合液用Source-Q阴离子交换柱纯化。选用rhFGF20单克隆抗体检验所获目标蛋白。　　体外生物学活性检测:选用NIH3T3细胞MTT活性实验，给药0、25、50、100、200、400 ng/mL。同时NIH3T3细胞给药rhFGF200/0.1/0.5/2.5μg/mL刺激30分钟，Western blotting检测p-ERK1/2变化情况。　　结果:SUMO-rhFGF20融合蛋白实现了高效可溶性表达。选用Ni亲和层析柱成功纯化获得SUMO-rhFGF20融合蛋白，进一步利用SUMO蛋白酶特异性酶切并纯化获得了rhFGF20。NIH3T3细胞MTT和Western blotting实验证明，所获得rhFGF20能有效激活细胞ERK1/2通路，增加p-ERK1/2水平，并呈现剂量依赖性，结果证明本法所获得的rhFGF20具有很好的生物学活性。　　结论:本研究利用的SUMO融合表达系统显著提高了rhFGF20的可溶性表达效率。Western blotting检测和细胞实验分析证实该方法能获得具有很好天然生物学活性的rhFGF20。本研究有效解决了制约rhFGF20可溶性表达和中试放大的技术瓶颈。