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目的：对载质粒DNA的高分子脂质体进行性能分析,优化其转染条件；观察其细胞毒性及转染不同细胞的转染效率；研究高分子脂质体作为基因载体在氧诱导视网膜病变动物模型中对视网膜新生血管的抑制作用,体现其独特的穿膜能力和缓释功能,为将来制备靶向性药物/基因共载多功能给药系统提供实验基础和理论依据。方法：1.课题组自行合成羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐(OQLCS/chol)纳米粒子,将穿膜肽(Tat)与其表面的功能基团连接制备出兼具跨膜、长循环功能的高分子脂质体,并对其表征进行检测。研究该高分子脂质体对质粒DNA在不同质量比、不同作用时间及血清存在与否条件下的包载效能,制定最优的转染条件；采用高速离心法进行体外释放动力学实验,绘制体外释放曲线；利用CCK-8法检测不同浓度高分子脂质体在不同时间分别对视网膜色素上皮(RPE)细胞的毒性,找到适于细胞转染的安全浓度；在优化条件下转染RPE细胞,同时以商品化的Lipofectamine2000做对照,比较两者的转染效率。2.建立缺氧条件下RPE细胞模型,转染48时后收集细胞上清通过ELISA法检测各组VEGF量的变化,细胞爬片后行免疫组织化学染色分析各组VEGF蛋白的表达,采用Real-time PCR检测各组RPE细胞内VEGF mRNA的变化。3.采用改良的Smith’s法建立氧诱导视网膜病变C57BL/6J小鼠模型,共95只,另有27只小鼠于正常氧环境中饲养。P11天时行小鼠玻璃体腔内注药,不同时间点,于正常打药组中随机选取两只小鼠行视网膜铺片,荧光显微镜下观察GFP的表达情况；各组中抽取两只小鼠FITC-dextran心脏灌注后行视网膜铺片观察视网膜血管形态的变化；分别于各组随机抽取两只小鼠,行HE染色,统计突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数；于各组随机抽取的两只小鼠做5gm冰冻切片,DAPI核染后荧光显微镜下观察,以反映高分子脂质体携带质粒DNA的穿膜能力。结果：1.纳米粒平均粒度为134nm,Zeta电位为+39.64mV,包载质粒后为236nm。透射电镜下纳米粒呈大小均匀的圆形粒子。体外释放实验显示载质粒DNA的高分子脂质体在体外最初5天为突释相,约有70%的质粒释放；此后至第14天呈稳态缓释。该高分子脂质体毒性较低,最高安全浓度为20ug/mL。2.通过电泳阻滞实验,筛选出高分子脂质体与质粒DNA质量比≥2：1时、混合时间为30-40min、无血清存在的培养液为最优转染条件；并以此条件转染RPE、Hela及RF/16,对RPE的转染率约为69%,对Hela细胞的转染效率约为52%,对RF/16转染效率约为80%。3.对缺氧后的RPE转染后观察,高分子脂质体组和Lipo组均能有效地将质粒DNA转染入细胞并表达。48小时后收集细胞上清,行ELISA法检测各组VEGF量,高分脂质体组和Lipo组中VEGF含量较模型组明显降低,差异均有显著性(P<0.01),其中Lipo组抑制程度略较高分脂质体组大,但差异不具有显著性(P=0.10)。72小时后行细胞免疫组化显示细胞内VEGF的变化,Lipo组和高分脂质体组对VEGF表达产生明显的抑制作用,胞浆内棕色着染明显淡薄,OD值相比高分子脂质体组略低于Lipo组(P=0.443)。Real-time PCR结果显示转染后48小时,高分脂质体组和Lipo组VEGF mRNA的变化与ELISA结果相似。4.成功建立了氧诱导视网膜病变小鼠模型。玻璃体腔内注射后可见注药后第1天视网膜内即有GFP表达,至第6天达到高峰,第11天时在高分子脂质体组仍能看到GFP表达,Lipo组不明显。FITC(?)心脏灌注后显示视网膜无灌注区及新生血管范围在高分子脂质体组及Lipo组明显改善,效果相当。HE染色后行突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数,结果表明P17天时高分子脂质体组及Lipo组均能有效抑制新生血管生成,P22天时,高分子脂质体效果仍能显现,新生血管内皮细胞核数较Lipo组少,差异具有显著性(P<0.01)。冰冻切片显示,注射后第1天,在高分子脂质体组及Lipo组均可以观察到玻璃体腔内有GFP的表达,高分子脂质体组有部分于视网膜表面表达；注射后第6天,两组的表达量均较高,且GFP表达位于RPE层附近；注射后第11天,在高分子脂质体组切片中仍能找到GFP的表达,但在Lipo组已很难找出。行VEGF的Western Blot检测,玻璃体腔内注射后6天,高分子脂质体组与Lipo组抑制效果相当(P=0.092)；P22时高分子脂质体组较Lipo组抑制明显,差异有显著性(P<0.05)。Real-timePCR结果与western blot结果相似。结论：1.自行制备的Tat化的高分子脂质体O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐/胆固醇具有粒径均匀、分散性好、Zeta电位较高、细胞毒性较小的特点,体外释放能在较短时间达到治疗浓度,后续可缓慢平稳释放。2.该高分子脂质体能携带基因很好的转染RPE细胞、Hela细胞及RF/16细胞,转染效率与商品化的Lipofectamine2000相当。3.该高分子脂质体携带治疗基因可以减少视网膜新生血管的生成,且具有显著的穿膜能力及缓释功能,在体内可维持较长时间的治疗效果,具有临床应用的开发前景。