论文部分内容阅读
香叶木苷又名地奥司明(Diosmin)是香叶木素(3’,5,7-三羟基-4’-甲氧基黄酮)的苷元部分,在柑橘类水果、芸香科植物如两面针、茜草科药用植物如蓬子菜等天然植物中的含量丰富。近年来有报道,香叶木苷可抑制肿瘤细胞增殖,对癌细胞具有特异性促凋亡活性和化学预防作用,因而被认为是有潜质的抗肿瘤药物。本文将对香叶木苷对肿瘤细胞的增殖与凋亡等方面的机制作以研究。本研究的主要结果如下:(1)利用清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基及ABTS自由基法、亚铁离子螯合法和总还原力测定法对槲皮素、芦丁、橙皮苷和香叶木苷的体外抗氧化活性进行比较,验证了香叶木苷具有较强的抗氧化活性,其抗氧化能力与槲皮素、芦丁接近。(2)利用MTT法筛选香叶木苷对6种癌细胞系的增殖抑制作用,实验表明,香叶木苷对HepG2肝癌细胞的作用效果最明显,150μg/m L时开始有效果,200~400μg/m L作用效果显著且抑制率接近,因此选择200μg/m L为最佳浓度深入研究香叶木苷抑制HepG2肝癌细胞的作用机制。(3)对香叶木苷作用于HepG2肝癌细胞的机制的进一步研究得到以下结果:倒置显微镜直接观察发现作用3~5 h后细胞出现肿胀变形,7 h后出现小颗粒状物质,部分细胞呈碎块状,细胞数量明显减少,给药后出现枝状结晶;HE染色后观察发现3~5 h后胞内染色质聚集混乱,7 h后细胞膜被损坏,染色体断裂,细胞周围形成小泡,多数细胞呈碎裂状;利用流式细胞仪检测细胞周期分布,发现给药组处于G0/G1、G2/M期细胞的数量显著减少,S期细胞变化不明显,推测香叶木苷可能破坏G0/G1、G2/M期;利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,发现大部分细胞处于凋亡晚期或死亡区域内;利用DCFH-DA法测定给药后细胞内ROS的变化,发现给药后荧光强度明显增加,说明香叶木苷可诱导细胞内ROS的产生;荧光显微镜观察发现细胞由原来的多角形、菱形变圆,产生大小不一的圆形小颗粒,部分细胞局部出现破洞,随着作用时间延长细胞碎裂程度越高,推测香叶木苷可诱导HepG2肝癌细胞发生坏死作用。(4)探讨香叶木苷对HepG2肝癌细胞蛋白水平的影响,实验采用2-DE蛋白质双向电泳对细胞全蛋白进行表达差异的蛋白点进行筛选,在给药组凝胶上检测到976个蛋白点,空白组凝胶上检测到787个蛋白点,其中只在给药组中出现的蛋白点有265个,只在空白组中出现的蛋白点有2个,相对于空白组,给药组有42个蛋白点2倍上调。利用MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术,对选取的7个差异蛋白点进行分析,并依据Gene Ontology、KEGG Pathway及String Network对其生物学功能进行下一步分析。最终推测香叶木苷对HepG2肝癌细胞的损伤作用的可能通路如下:与ACTA2相关的可能通过破坏细胞骨架结构,并调控Raf/MEK/ERK/Ca D通路与PI3K/Akt而起作用;与ENO2相关的可能与氨基酸的生物合成及糖代谢途径相关;与PKM相关可能与Ca信号通路和c AMP信号通路相关;与Hsp A8相关的可能为调控TGF-β/RTK/clathrin、MKK4/7/JNK/c-JUN/Jun D或JNK/MKP/PTP/p38及NF-κB通路;与AFP相关的可能为调控Hippo-YAP和Akt通路。因此推测香叶木苷对HepG2肝癌细胞的破坏作用可能是多途径共同参与的。