鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHAV)引起的主要危害1月龄以内雏鸭的一种高度致死性疾病;DHAV分为DHAV-1、DHAV-2及DHAV-3 3个血清型;我国DVH主要由DHAV-1和DHAV-3引起;DHAV-3的出现及DHAV-1与DHAV-3的一同流行是我国DVH不能得到控制的主要原因。鸭病毒性肠炎是由鸭肠炎病毒(DEV)引起的主要感染鸭、鹅等水禽的致死性传染病;DEV属疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科马立克病毒属,其基因组较大且其感染具有宿主特异性,因此,以其为病毒载体构建二价重组病毒活载体疫苗成为研究的热点。本研究的主要内容包括两方面,分别为DHAV-3广东分离株的致病性的系统性研究及表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建及其免疫保护效果的评价。1.DHAV-3致病性的研究(1)DHAV-3毒力的鉴定将分离于广东的DHAV-3进行鸭胚攻毒及雏鸭回归试验,对该病毒感染致死雏鸭临床症状、组织病理变化及病毒载量进行观察及检测,并测定该病毒的鸭胚半数致死量及雏鸭半数致死量,结果显示,该病毒可快速引起鸭胚及雏鸭死亡且死亡率极高,剖检观察到肝脏、脾脏及胆囊出现严重的组织损伤,并引起雏鸭心、肝、脾、肺、肾、十二指肠及脑等组织器官出现不同程度的病理损伤,病毒拷贝数在肝脏中最高,脾脏次之,胸腺及肌肉中最低,且对11日龄鸭胚的LD50为10-5.167/0.2mL,对5日龄雏鸭的LD50为10-6.375/0.2mL。(2)雏鸭感染DHAV-3后肝脏的转录组分析以10LD50的DHAV-3感染5日龄雏鸭,利用RNA-Seq筛选病毒感染后12h及48h雏鸭肝脏中的差异表达基因,并对筛选获得的差异表达基因进行GO功能分类及KEGG信号通路分析;结果显示,感染后12 h和48 h,肝脏中基因表达模式差异显著,且感染后48 h,大量的免疫相关基因出现上调,并显著富集在细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路、RIG-1样受体信号通路、细胞凋亡及Jak-STAT信号通路等。(3)雏鸭感染DHAV-3天然免疫应答相关分子的检测利用实时荧光定量PCR方法对10LD50DHAV-3感染后3h、6h、9h、12h、24h、36h及48 h雏鸭肝脏及脾脏中DHAV-3的病毒载量及12种免疫应答相关分子的相对表达量进行检测,结果显示,雏鸭感染DHAV-3后3 h即可在肝脏及脾脏中检测到低拷贝的病毒,肝脏中的12种免疫应答分子的表达呈现不同程度的上调,但脾脏中的表达呈现多样性;感染后6 h～24 h,雏鸭肝脏及脾脏中的免疫应答分子的表达模式不同,随着时间的延长,病毒拷贝数的大量累积,至感染后36h～48 h,观察到大多数免疫相关分子出现不同程度的表达上调,但最终雏鸭未能抵抗DHAV-3的感染而死亡。2.表达DHAV-3 VP1基因重组鸭肠炎病毒的构建(1)DHAV-3全基因的克隆及其VP1蛋白抗原优势区的鉴定根据GenBank已公布的DHAV-3参考序列,将DHAV-3基因组分成6段相互重叠的片段,利用合成的简并引物对DHAV-3的全基因序列进行克隆;利用PCR方法克隆获得DHAV-3 VP1基因,并对该基因进行分段截短表达,利用鼠抗DHAV-3多抗及鸡源DHAV-3卵黄抗体对VP1蛋白的抗原优势区进行筛选和鉴定,初步确定DHAV-3 VP1蛋白的抗原优势区为90～175aa。(2)含gpt筛选标记的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建、筛选及鉴定将获得的VP1基因克隆至pcDNA3.1(+)中,扩增获得含CMV启动子、VP1基因及BHG pA的VP1表达盒基因,同时,以实验室保存的pMD18T-gpt表达盒质粒为模板,利用PCR方法在原gpt表达盒两端分别引入一个同向的loxP位点,扩增获得gpt-loxP表达盒基因,通过一系列酶切、连接的方式成功构建重组病毒转移载体pEASY-AUs10-gpt-loxP-VP1;将重组病毒转移载体pEASY-AUs10-gpt-loxP-VP1与DEV C-KCE基因组总DNA共转染至原代鸭胚成纤维细胞中,经11代霉酚酸加压筛选及4轮蚀斑纯化获得含有gpt筛选标记基因及DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒,PCR鉴定正确后,将其命名为rDEV-AUs 10-gpt-loxP-3-VP 1。(3)不含gpt筛选标记的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒的构建、筛选及鉴定将真核表达重组质粒pKozak-NLS-Cre与重组病毒rDEV-△Us10-gpt-loxP-3-VP1基因组总DNA再次共转至DEF,在Cre酶的作用下,将两个同向loxP位点间的gpt表达盒删除,而仅保留一个loxP位点,利用PCR方法对重组病毒进行鉴定,结果显示存在不含gpt表达盒的重组病毒后,再进行5轮蚀斑纯化后得到纯净的、仅含单一 loxP位点及VP1基因的重组DEV,经 PCR、RT-PCR、Western blot 及 IFA 等试验鉴定正确后,将其命名为 rDEV-AUs1 0-3-VP1;提取重组病毒rDEV-AUs10-3-VP1第1、5、10、15及20代基因组总DNA,PCR均可扩增到VP1基因,表明DHAV-3 VP1基因可在DEVC-KCE基因组中稳定存在;将rDEV-AUs10-3-VP1病毒液超离浓缩后进行透射电镜观察,结果观察到包含囊膜和衣壳的鸭肠炎病毒粒子形态。3.动物的免疫及攻毒(1)产蛋鸭的免疫以 2×105、5×105 及 1×106 PFU 的重组病毒 rDEV-△Us10-3-VP1 及 2×105 PFU 亲本病毒DEVC-KCE免疫产蛋鸭,初次免疫后3周进行加强免疫。结果表明,血清中针对DEV及DHAV-3 VP1的特异性抗体在加强免疫后的7 d达到高峰,卵黄中,则在加强免疫后的14 d达到高峰;血清及卵黄中特异性抗体效价与免疫剂量呈剂量依赖性;免疫后产蛋鸭血清及卵黄中的抗DEV中和抗体的变化趋势与特异性性抗体的变化趋势相似,而针对DHAV-3的中和抗体效价很低;免疫后产蛋鸭外周血中CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞数目均有所增加,但CD8+T淋巴细胞增加幅度更高,免疫后7dCD4+与CD8+T淋巴细胞比例下降,免疫后14d持续下降,直至免疫后21 d接近正常水平。(2)雏鸭的免疫及攻毒以5 × 105 PFU的重组病毒rDEV-△Us10-3-VP1单次免疫3日龄雏鸭,免疫后7 d进行DEV AV1222株强毒及DHAV-3强毒的攻毒,攻毒剂量为100LD50/只,逐日观察并记录雏鸭的临床症状及死亡情况,结果表明,DEV强毒攻毒组雏鸭在攻毒后2周,重组病毒及亲本毒免疫的雏鸭均出现2只死亡,而PBS对照组雏鸭全部死亡,表明DHAV-3 VP1基因的插入及DEV C-KCE US10基因的缺失,并不影响弱毒疫苗株DEV C-KCE为雏鸭提供免疫保护力以抵抗DEVAV1222株强毒的感染;而DHAV-3强毒攻毒组在攻毒后第4天,亲本毒及PBS对照组雏鸭即全部死亡,重组病毒免疫组余1只雏鸭,攻毒后第8天,重组病毒组雏鸭全部死亡,表明构建的表达DHAV-3 VP1基因的重组鸭肠炎病毒不能够为雏鸭提供有效的保护力以抵抗DHAV-3强毒的感染。本研究为探讨DHAV-3感染雏鸭快速致死的机制及雏鸭抵抗DHAV-3感染的相关免疫应答机制提供科学的数据支撑,为构建表达DHAV-3 VP1重组病毒活载体疫苗提供理论依据和技术平台,同时,完善本实验室DEV的反向遗传操作平台,为进一步探讨重组DEV候选插入位点及US10蛋白的生物学功能奠定物质基础。