胃饥饿素(Ghrelin)对衣霉素(Tunicamycin)诱导成骨细胞内质网应激的影响

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目的建立衣霉素诱导成骨细胞内质网应激的模型,探讨胃饥饿素(ghrelin)对衣霉素诱导成骨细胞内质网应激的影响。方法选取小鼠成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,(1)分别配制含有不同浓度的衣霉素(0、0.5、1、1.5μg/ml)培养基,分别孵育不同浓度的成骨细胞24 h后;采用CCK-8法检测细胞增殖活性;二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯探针(DCFH-DA)检测胞内活性氧(ROS)的含量;Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)检测各组细胞内内质网应激相关标志性基因CHOP、BIP、caspase-12 mRNA的表达。最后选择衣霉素作用最敏感浓度1.5μg/ml建立成骨细胞内质网应激的模型。(2)观察ghrelin对成骨细胞内质网应激的影响。分别用不同浓度的ghrelin(0、10-11、10-9、10-7 mmol/L)预处理成骨细胞4 h后,加入1.5μg/ml的衣霉素诱导成骨细胞内质网应激。培养结束后,利用上述方法检测细胞增殖活性、胞内ROS的含量、内质网应激相关标志性基因的表达。(3)统计学方法。采用统计分析软件SPSS 22.0进行分析,实验数据以均数±标准差(`X±S)表示。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)与对照组相比,不同浓度的衣霉素干预成骨细胞24 h后,细胞增殖和存活率呈浓度依赖性明显降低。而1.0μg/ml和1.5μg/ml的衣霉素干预细胞24 h后细胞增殖和存活率的降低有统计学意义(P<0.05),而0.5μg/ml的衣霉素干预后无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,胞内ROS的含量随浓度的增加逐渐增加,且均有统计学意义(P<0.05);qRT-PCR结果显示,与对照组相比,不同浓度衣霉素干预细胞后CHOP mRNA的表达均有明显的提高且均有统计学意义(P<0.05),而BIP、caspase-12 mRNA的表达只在浓度为1.0μg/ml和1.5μg/ml衣霉素干预后有统计学意义(P<0.05),而0.5μg/ml衣霉素干预后无统计学意义(P>0.05);(2)与单纯1.5μg/ml衣霉素相比,用不同浓度的ghrelin预处理成骨细胞4 h后再加1.5μg/ml衣霉素,发现细胞增殖和存活率随ghrelin浓度增高而增加,浓度为10-9、10-77 mmol/L ghrelin预处理后有统计学意义(P<0.05),而浓度为10-1111 mmol/L的ghrelin预处理后无统计学意义(P>0.05);与单纯1.5μg/ml衣霉素相比,不同浓度的ghrelin预处理后胞内ROS的含量减少,且均有统计学意义(P<0.05);qRT-PCR结果显示,在浓度为10-9和10-77 mmol/L ghrelin预处理后,CHOP mRNA表达降低有统计学意义(P<0.05),而浓度为10-1111 mmol/L的ghrelin预处理后无统计学意义(P>0.05)。对于BIP和caspase-12 mRNA的表达,不同浓度的ghrelin预处理后均有统计学意义(P<0.05)。结论衣霉素可以诱导成骨细胞内质网应激的发生,且随着浓度的增加而加重。而ghrelin在一定程度上可以抑制成骨细胞的内质网应激。
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