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兽药被广泛使用于动物饲养的过程中,用于预防、治疗疾病和促进动物生长,或在动物运输和屠宰过程中使用某些具有镇静作用的药物,可防止动物应激作用,降低动物死亡率,保证肉质。这些兽药包括抗生素类、镇静剂类、激素类等。抗生素类药物主要用药目的是抗菌,但有研究表明,抗生素类药物在抗菌的同时能够促进动物胃肠道对营养物质的吸收从而间接促进动物的生长,因此金霉素、土霉素、维吉霉素等抗生素长常作为动物添加剂使用。镇静剂类药物不言而喻具有镇静催眠的作用,在动物饲养过程中使用,可减少动物的活动,降低能量消耗促进生长缩短出栏时间;在动物运输过程中使用,减少动物的应激作用降低动物突然死亡率,这类药物常包括苯二氮卓类、巴比妥类和β-受体阻滞剂类药物。兽药的广泛使用促进了畜牧业的发展,然而也为人类的饮食健康带来了危害。抗生素的使用在上世纪已达到滥用的程度,被吸收进入动物体内的抗生素,部分随着血液循环进入身体各个肌肉组织中,导致药物残留。人类长期食用这类残留有抗生素的肌肉可能会引起严重的副作用并产生细菌耐药性,有报道指出的抗生素滥用导致的超级细菌亦不容忽视;而部分抗生素随着动物的粪便,尿液排泄到环境中,污染环境和饮用水。食用残留有镇静剂类药物的动物食品将导致肝脏负担加重,头脑长期昏沉,记忆受影响,运动神经与肌肉功能受到抑制等副作用。为保证人类食品健康安全,欧盟相关规定禁止将抗生素作为促生长剂使用于动物饲养过程中,我国亦建立相关的检测标准和限量规定;农业部176、235号公告规定严禁在饮用水和动物饲料中使用镇静剂类药物,且不得在动物源性食品中检出此类药物。本文经过对样品前处理条件、仪器条件和分析方法的筛查优化,分别建立了牛肉、牛血液和尿液中15种抗生素类药物和牛肉中20种镇静剂类药物的UPLC-MS/MS法,实验结果表明方法灵敏度高且具有良好的重现性和准确性1。第一部分超高效液相色谱-串联质谱法分别检测牛肉、牛血液和牛尿液中15种抗生素类药物目的:建立牛肉、牛血液和牛尿液中15种抗生素类促生长剂的UPLC-MS/MS法。方法:在牛肉或血液样品中加1 m L 0.1 mol/L EDTA-2Na溶液和9 m L乙腈并涡旋30秒,振荡提取10分钟,离心后移去上清液至另一个50 m L离心管中。再向残渣加入10 m L乙腈-水(90:10,V/V)重复提取一次,离心后合并两次上清液然后充分混匀,用移液管移取10 m L至15 m L玻璃管中,于40℃氮吹仪下氮气吹干,残渣用1 m L乙腈-水(3:7,V/V)复溶。尿液中目标化合物的提取方法是加入1 m L0.1 mol/L EDTA-2Na溶液并将p H调节至5.2,振荡5分钟,然后将样品转移到HLB柱上净化,用3 m L甲醇-水(10:90,V/V)洗涤,再用甲醇-乙酸乙酯(1:1,V/V)洗脱分析物,收集洗脱液40℃氮气吹干,残渣用1 m L乙腈-水(3:7,V/V)复溶。色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7μm),流动相成分A为乙腈,B为含有0.2%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液,流速为0.3 m L/min,柱温40℃。质谱条件:正离子模式(ESI+),电喷雾电压:5.5k V;雾化气压力:0.45MPa;气帘气压力:0.21MPa;辅助气体压力:0.41MPa;离子源温度:650℃;碰撞室入口电压:10V。采用基质匹配标准曲线降低干扰并进行定量。结果:向空白样品中添加水平分别为10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg的标准溶液,进行加标回收率测定,每个浓度水平重复测定6次。牛肉,血液和尿液中15种化合物的平均回收率分别为74.6%-119.3%,75.7%-110.6%和75.9%-119.2%。牛肉,血液和尿液中相对标准偏差RSD%分别在1.1%～14.1%,1.0%～13.6%和1.1%～14.7%范围内。结论:该方法快速,灵敏好、前处理简单,回收率好,为检测牛肉,牛血液和牛尿液中抗生素类促生长剂提供技术保障。第二部分超高效液相色谱-串联质谱法同时检测牛肉中镇静剂和β-受体阻滞剂类药物目的:建立同时检测牛肉中镇静剂和β-受体阻滞剂的UPLC-MS/MS法。方法:样品中加入15 m L 0.26 mol/L氨水-乙腈(8:92,V/V)提取液和40 u Lβ-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酯酶混合液,加盖后涡旋混匀2 min,于37℃110 r/min摇床中酶解16 h;酶解后向离心管中加入2 g无水硫酸钠于振荡器上振荡提取30分钟,7000r/min下离心3分钟,移取上清液浓缩至干。取3 m L 0.1 mol/L盐酸溶解残渣,经HLB小柱净化,用3 m L甲醇-水(5:95,V/V)溶液润洗,再分别用3 m L甲醇3 m L乙腈洗脱,收集洗脱液氮气吹干;取1m L乙腈-水(1:9,V/V)溶液溶解残渣。色谱柱:ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1×100 mm,1.7μm);流动相:正离子模式(ESI+):流动相A为乙腈,流动相B为2 mmol/L乙酸铵溶液(含0.2%甲酸)。负离子模式(ESI-):流动相A为乙腈,流动相B为水,流速为0.3 m L/min,柱温40℃。质谱条件:正离子模式(ESI+):电喷雾电压5.5KV;雾化器压力0.4MPa;气帘气压力0.4MPa;辅助气压力0.5MPa;离子源温度500℃;碰撞室入口电压(EP)10V;负离子模式(ESI-):电喷雾电压4.5KV;雾化器压力0.4MPa;气帘气压力0.4MPa;辅助气压力0.5MPa;离子源温度500℃;碰撞室入口电压-10V。采用基质匹配标准曲线降低干扰并进行定量。结果:20种目标化合物在0.5~50μg/L范围内呈良好的线性关系(r2≥0.99),检出限为0.012~0.604μg/kg,定量限为0.041~2.016μg/kg。向空白样品中添加0.5、1.0、5.0μg/kg三个浓度水平重复测定6次平均回收率为71.2%-123.8%,RSD%值在1.1%-14.9%之间。结论:该方法的准确度、灵敏度、重现性等各项技术指标能够满足兽药残留分析要求,从而为动物源性食品中镇静剂和β-受体阻滞剂的检测提供了可靠准确的技术保障。