脑胶质细胞瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，目前，对于胶质细胞瘤患者的治疗，虽然给予积极的手术、放、化疗等治疗措施，但患者预后仍较差。文献报道，WHO分级3级的胶质细胞瘤患者平均生存期约3-5年，多形性胶质母细胞瘤患者平均生存期尚不足1年，治疗策略的调整及寻找胶质细胞瘤治疗的新靶点，是我们当前亟待解决的难题。野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1（the wild–type p53-inducedphosphatase1, Wip1）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2C(PP2C typeprotein phosphatase)家族中的一员,由PPM1D (protein phosphatasemagnesium-dependent1delta)基因编码,位于人染色体17q23/q24区域。2002年，Bulavin等通过实验表明，在野生型小鼠胚胎成纤维细胞转化中，Wip1与Ras, Myc和Neu1等原癌基因具有协同作用，证实它是一种新型原癌基因，并对其发挥致癌作用的可能机制进行探讨，发现主要与高表达Wip1能够促使其作用的下游靶蛋白ATM、chk1/chk2、p38MAPK-p53去磷酸化失活，导致肿瘤的发生。近年来，人们相继发现Wip1在乳腺癌，神经母细胞瘤，卵巢癌，髓母细胞瘤等肿瘤中存在高表达，并且已经发现高表达的Wip1与乳腺癌、胃癌及胰腺癌等肿瘤患者的预后差密切相关。目前，人们已经成功开展了以Wip1为靶点的基因治疗的动物体内外实验，并取得了较好的疗效。然而，针对Wip1在人脑胶质细胞瘤中的研究报道仅限于高级别胶质细胞瘤表达高于低级别胶质细胞瘤，针对不同级别、不同类型胶质细胞瘤组织中Wip1表达水平、Wip1表达与胶质细胞瘤患者预后的相关性及其对多形性胶质母细胞瘤细胞增殖作用等研究尚未见报道。基于上述研究背景，我们试图检测Wip1在不同级别、不同类型胶质细胞瘤组织中的表达，明确Wip1在胶质细胞瘤组织中的表达水平，进一步通过生存曲线分析观察Wip1表达与患者预后的相关性。研究表明，经紫外线照射的p53野生型Burkitt淋巴瘤细胞株能够诱导Wip1表达，而经紫外线照射的p53突变型Burkitt淋巴瘤细胞株却不能够诱导Wip1表达。p53作为最初被发现的抑癌基因，乳腺癌肿瘤组织中存在Wip1表达与p53的表达呈负相关，p53表型不同的乳腺癌其Wip1表达差异性较大，并决定患者预后。因此，探讨p53与Wip1表达的相关性具有重要意义。检测不同p53表型的胶质瘤细胞株中Wip1表达情况对理解胶质细胞瘤恶性生物学特性尤为重要，我们拟通过不同的实验方法观察胶质瘤细胞株U87(p53-野生型)和U251(p53-突变型)中Wip1表达情况，筛选Wip1优势表达细胞株，为进行下步实验奠定基础。原癌基因的启动或高表达是肿瘤发生发展的重要原因，治疗策略是拮抗其表达，最常用的基因治疗手段是RNA干扰技术，探讨应用RNA干扰技术沉默Wip1基因对胶质细胞瘤细胞增殖功能的影响，从而实现肿瘤生长抑制的目的，以期为胶质细胞瘤的基因治疗奠定理论基础。本学位论文涉及的研究内容主要包括三部分：第一部分: Wip1在人脑胶质细胞瘤组织中表达及其临床意义目的：观察Wip1在不同级别、不同类型人脑胶质细胞瘤组织和正常脑组织中的表达情况，探讨Wip1的表达水平与胶质细胞瘤病理级别、病理类型、肿瘤大小等临床特性及其与患者预后的相关性。方法：1标本采集收集河北医科大学第二医院神经外科2003年12月-2005年12月期间81例行手术切除取得的胶质细胞瘤组织及15例正常脑组织，正常脑组织取自颅脑外伤患者内减压术。所有标本经两名以上神经病理医师诊断确诊。81例患者中，男性48例，女性38例，术前对患者进行KPS评分，所有患者术前均无放、化疗和免疫治疗史；标本取材后，部分投至液氮中速冻；另一部分标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，行免疫组化染色。术后记录肿瘤病理级别、肿瘤大小及生长部位等临床特征。对所有入组患者给予手术、放疗及化疗三种综合治疗方法，自术后6个月~1年开始进行电话或信件随访。2采用免疫组织化学方法（SP法）分别检测胶质细胞瘤组织及正常脑组织中Wip1, p53和PCNA的表达情况。3分析Wip1表达与胶质细胞瘤患者年龄、性别、肿瘤病理级别、大小、位置、KPS评分、PCNA及p53表达的关系。通过单因素Log-rank（Kaplan-Meier）生存曲线分析Wip1表达与患者预后相关性，进一步行Cox回归模型分析高Wip1表达相对危险度。4逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chine reaction，RT-PCR）检测胶质细胞瘤组织及正常脑组织中Wip1mRNA的表达情况。5Western blot检测胶质细胞瘤组织中Wip1蛋白表达。结果：1免疫组织化学结果显示：Wip1蛋白在肿瘤细胞浆和细胞核着色，在恶性度较高的胶质细胞瘤血管壁上亦存在阳性物质着色。在胶质细胞瘤组织中的表达阳性率为55%(45/81)，15例正常脑组织中Wip1呈弱表达或阴性表达，高级别和低级别胶质细胞瘤组织阳性表达率分别为81.4%（35/43）和26%（10/38），胶质细胞瘤组织Wip1阳性表达高于正常脑组织，差异具有显著的统计学意义（P＜0.01），高级别胶质细胞瘤组Wip1表达高于低级别组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2RT-PCR结果显示Wip1mRNA在高级别、低级别及正常脑组织中相对表达量分别为0.28±0.03，0.25±0.04和0.08±0.01, Wip1在脑胶质细胞瘤组织中的表达高于正常脑组织，具有统计学差异（P＜0.05），但在高级别和低级别胶质细胞瘤之间Wip1mRNA表达无统计学差异（P＞0.05）。3Western blot结果显示Wip1在IV级胶质细胞瘤、III级胶质细胞瘤及II级胶质细胞瘤中的表达相对量分别为3.05±0.18，2.53±0.11和1.71±0.10，不同级别胶质细胞瘤组织之间Wip1的表达具有统计学差异（P＜0.05），并且随胶质细胞瘤病理级别的增高，Wip1表达有增高趋势；而不同类型、同级别的胶质细胞瘤组织中Wip1表达不具有统计学差异（P＞0.05）。4p53，PCNA在脑脑胶质细胞瘤中的表达及其与Wip1表达的相关性p53免疫组织化学结果显示，阳性表达位于细胞核，在高级别胶质细胞瘤中的阳性表达率为72%(31/43)，在低级别胶质细胞瘤中阳性表达率为50%，在正常脑组织中呈阴性表达。PCNA免疫组织化学结果显示，阳性表达位于细胞核，在胶质细胞瘤中的阳性表达率为89%(72/81)，并且随胶质细胞瘤病理级别的增高而表达增高，而在正常脑组织中呈阴性表达。5Wip1高表达与胶质细胞瘤患者的年龄、性别、肿瘤位于幕上/幕下无关（P＞0.05）。Wip1高表达与肿瘤大小、KPS评分、病理级别、PCNA及p53表达有关（P＜0.05）。Spearman秩相关分析检验得出PCNA免疫标记指数与Wip1表达密切相关(r=0.639，P＜0.001)。6单因素Log-rank生存曲线分析（Kaplan-Meier）显示WHO分级、肿瘤大小、KPS评分及Wip1表达与患者预后相关（P＜0.05）。进一步行CoX回归模型分析显示Wip1高表达, KPS评分（KPS＜80），WHO分级(III~IV)相对危险度与对照组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：1Wip1在人脑胶质细胞瘤组织中表达高于正常人脑组织，Wip1表达随肿瘤病理级别的增高而表达增高，低级别胶质细胞瘤和高级别胶质细胞瘤中Wip1mRNA表达无统计学差异，但高级别胶质细胞瘤中Wip1蛋白表达要高于低级别胶质细胞瘤中Wip1蛋白表达，具有统计学差异，即胶质细胞瘤组织中Wip1mRNA和蛋白表达水平存在不一致，推测这一现象与Wip1蛋白转录后调控机制的存在及其半衰期长短有关。2Wip1高表达与胶质细胞瘤患者预后差密切相关。3Wip1与p53表达呈正相关，与Wip1是由p53诱导产生有关。Wip1与PCNA表达呈正相关，二者在胶质细胞瘤的恶性浸润性生长中可能起到协同作用。4Wip1表达与胶质瘤病理级别、大小、PCNA表达、p53表达及患者KPS评分有关。Wip1表达与患者年龄、性别和胶质瘤位于幕上/下无关。第二部分: Wip1在多形性胶质母细胞瘤细胞株中的表达目的：观察Wip1在p53表型不同的人多形性胶质母细胞瘤细胞株(U87和U251细胞)中的表达情况，筛选Wip1优势表达细胞株；同时检测p53Wip1，Wip1PCNA在胶质细胞瘤细胞株中共表达情况。方法：1免疫细胞荧光技术检测人多形性胶质母细胞瘤U87和U251细胞中Wip1表达。2免疫荧光技术检测p53/Wip1和Wip1/PCNA在U87和U251细胞中的共表达。3流式细胞技术检测Wip1在人脑胶质细胞瘤U87和U251细胞中的表达。4逆转录聚合酶链反应检测Wip1mRNA在人脑胶质细胞瘤U87和U251细胞中的表达。5Western blot检测不同p53表型的人脑胶质细胞瘤U87和U251细胞中Wip1蛋白表达。结果：1免疫细胞化学荧光染色显示，Wip1在p53野生型的U87胶质瘤细胞株中的表达高于p53突变型的胶质瘤细胞株U251中的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2免疫细胞荧光染色结果提示两种细胞株中均存在p53/Wip1、Wip1/PCNA共表达现象。3流式细胞技术检测到U87细胞株Wip1平均荧光强度（X-mode值）高于U251细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。4RT-PCR和Western blot检测结果显示U87细胞Wip1mRNA和蛋白表达均高于U251细胞（P＜0.05）。结论：1筛选出的p53野生型胶质细胞瘤细胞株—U87细胞,为Wip1优势表达细胞株，对进一步开展以Wip1为靶点的基因治疗提供基础。2p53/Wip1在胶质细胞瘤细胞株存在共表达，与Wip1由p53诱导产生有关；PCNA/Wip1在胶质瘤细胞株中存在共表达，二者在胶质细胞瘤细胞的增殖过程中可能起到协同作用。第三部分Wip1对人多形性胶质母细胞瘤细胞株U87的增殖作用的相关性研究目的：构建Wip1RNA干扰慢病毒载体，并感染至胶质细胞瘤细胞株U87，探讨Wip1在人多形性胶质母细胞瘤细胞U87增殖中的作用。方法：1构建合成Wip1shRNA干扰慢病毒载体，建立稳定转染的Wip1-/-U87细胞。2逆转录聚合酶链反应检测Wip1-shRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天及7天细胞Wip1mRNA相对表达量变化。3Western blot检测Wip1-shRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天及7天细胞Wip1蛋白表达变化。4四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验检测U87细胞转染Wip1-shRNA慢病毒感染1天、2天、3天、4天、5天及7天后细胞增殖能力变化。5流式细胞技术（FCM）检测Wip1-shRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天及7天细胞周期变化。结果：1成功构建合成Wip1shRNA干扰慢病毒载体，并经阳性克隆测序证实。U87细胞Wip1mRNA和蛋白表达水平在转染慢病毒载体后均低于阴性转染组及空白对照组，以转染后3天表达水平最低，差异具有统计学意义（P＜0.05）,空白对照组及阴性转染组相比，二者差异无统计学差异(P＞0.05)。2MTT法检测结果提示Wip1-shRNA慢病毒转染组U87细胞生长增殖速度受到显著抑制,其中以转染后3天抑制效果最为明显,慢病毒转染组增殖率为20.15±6.22%,而阴性转染组及空白对照组增殖率分别为43.56±5.56%和48.37±6.13%，慢病毒转染组与空白转染组及阴性转染组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)；空白对照组及阴性转染组相比，二者之间差异无统计学差异(P＞0.05)。3流式细胞仪检测结果显示,慢病毒转染组与阴性转染组及空白对照组相比，转染后1天、2天、3天、4天细胞周期比例未见明显差异，但转染慢病毒载体组细胞于转染后第5天开始S期细胞出现增多, G2/M期细胞明显减少，于转染后第7天该现象最为明显(P＜0.05)。阴性转染组与空白对照组相比较，二者之间S期细胞比例差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：1成功构建合成Wip1shRNA干扰慢病毒载体，并经测序验证证实，建立了Wip1-/-稳定转染U87细胞株，所构建的慢病毒载体对U87细胞Wip1mRNA和蛋白的表达能够产生抑制作用。2转染Wip1shRNA慢病毒干扰载体，能够使U87细胞增殖受到明显抑制,Wip1基因对胶质瘤细胞的恶性增殖起重要作用。