论文部分内容阅读
大脑皮层神经网络的正确建立是哺乳动物大脑执行感觉、运动和认知功能的基础。神经元的树突发育是神经网络形成的关键一步,由不同分子在时间和空间上精确的调节。在大脑皮层的关键区域中,树突的发育缺陷可导致神经网络的异常,从而引起神经发育障碍。压后皮层（retrosplenial cortex,RSC）就是其中一个关键区域,它支持高级认知功能,其损伤及病变与多种神经系统疾病密切相关。这些疾病严重损害病人的生活质量,如何治疗这类疾病是医疗和制药领域面临的巨大挑战。研究压后皮层神经元发育的分子机制对于治疗RSC的病变至关重要。Wnt信号通路与大脑发育密切相关,但其是否参与调节树突的发育并未解析;仅发现Wnt信号通路在体外培养的神经元中调节树突的分支,缺乏体内真实生理环境中的相关研究和证据。论文围绕经典Wnt信号通路在大鼠压后皮层内调节锥体神经元树突发育作用开展研究:首先,探索了经典Wnt信号通路在RSC第2层（Layer 2,L2）神经元树突发育中的作用。通过子宫内电穿孔技术在大鼠胚胎期（Embryonic day,E）第18天（以下简称为E18）时导入经典Wnt信号通路的报告质粒pCLX-M38TOP-dGFP和对照质粒,统计出生后不同时间点（出生后第0、4、10、21和45天）RSC中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）阳性神经元所占比值,结果发现相比于迁移中的神经元,到达L2的神经元的GFP 阳性神经元比值显著提高,但各时间点之间并无显著区别。说明经典Wnt信号通路在RSCL2神经元的发育过程中持续表达。在E18时的胎鼠大脑中分别导入可诱导型慢病毒表达质粒 pCWXPGR-pTF-dnTCF4、pCWXPGR-pTF-ΔDIX 和 pCWXPGR-pTF-β-cat,并从E21至出生后（Postnatal day,P）第21天激活质粒的表达,实现在RSC L2神经元的发育过程中经典Wnt信号通路表达下调与上调。在P21时取大脑切片,通过电离子导入单细胞荧光染料注射技术及neurolucida软件重建神经元形态学结构,并提取量化数据,分析树突的长度、分支点数量等指标,结果发现下调表达Wnt信号通路后,树突长度、分支点数量相比于对照组均显著减少;而上调表达Wnt信号通路后,树突长度、分支点均显著增加,且在体觉皮层L2/3锥体神经元中重复实验得到类似结果。这一研究证实了经典Wnt信号通路可调节大脑皮层L2锥体神经元树突的发育。其次,探索了经典Wnt信号通路调节树突发育的关键时间窗。在E18时通过子宫内电穿孔技术于胎鼠大脑中导入下调经典Wnt信号通路表达的质粒pCWXPGR-pTF-dnTCF4和对照质粒,使Wnt信号表达水平从E21至P15时下调,在P90时发现实验组树突的长度和分支点数量仍显著减少,表明由经典Wnt信号通路表达水平失调引起的树突发生缺陷是不可逆的。接着在E18时导入同样的质粒,并在发育过程中的不同时间段内使Wnt信号水平表达下调,在P21时分析实验组与对照组的树突长度与分支点数量,发现经典Wnt信号通路调节树突分支的关键时间窗为E21至P7。同时,探索了在该时间窗内树突发育与神经活性之间的关系:通过使用DREADDs技术（pCWXPG-hM3Dq质粒和N-氧化氯氮平）和可诱导型表达质粒pCWXPGR-pTF-Kir2.1实现增加或抑制神经活性。结果发现,在E21至P7时无论增加还是抑制神经活性,实验组树突的长度与分支点数量与对照组无显著性差异,并且增加神经活性不能完全挽救由Wnt信号通路表达水平失调引起的树突发育缺陷。这一结果说明,在发育早期时RSC L2神经元树突生长和分支不依赖于神经活性。再次,探索了经典Wnt信号通路在调节树突发育过程中与神经营养因子3（Neurotrophin,NT3）之间的关系。通过原位杂交技术发现NT3在RSC L2中从P0至P9强烈表达。进一步在E21至P7时经典Wnt信号通路表达下调的大鼠大脑中发现,NT3的mRNA水平显著降低。结合生物信息分析结果,提示NT3可能是经典Wnt信号通路转录途径的下游分子。构建RNA干扰质粒,在E18时通过子宫内电穿孔技术将其导入胎鼠大脑,从E21至P7时表达,结果在P7时发现抑制NT3的表达可引起树突的长度和分支点数量显著降低。构建NT3过表达质粒pCWXPGR-pTF-NT3,将其与下调经典Wnt信号通路表达的质粒在E18时联合导入胎鼠大脑中,并在E21至P7同时表达,结果发现在P7时树突的长度、分支点数量都显著高于经典Wnt信号通路表达下调组,并与对照组无显著差异,说明NT3可以挽救Wnt信号通路功能缺失引发的树突缺陷.证实经典Wnt信号通路通过NT3调节树突发育。最后,分析了经典Wnt信号通路与树突棘发生的关系。在E18时的胎鼠大脑中导入下调经典Wnt信号通路的质粒,使其从P21至P30时即树突棘发生时期表达,在P30时发现实验组的树突棘密度比对照组显著减少,成熟树突棘的数量也显著减少。说明在树突发育后期,经典Wnt信号通路功能缺失可抑制树突棘的形成和成熟。通过使用DREADDs技术增加神经活性,发现可挽救由Wnt信号通路表达下调引起树突棘密度减少,说明树突棘发生依赖于神经活性。利用原位杂交技术发现NT3从P21至P25时在RSC L2中高表达;通过将NT3过表达质粒与经典Wnt信号通路下调表达质粒联合导入E18胎鼠的大脑中,并在P21至P30同时表达,结果发现树突棘的密度显著高于Wnt信号通路下调表达组,并与对照组无差异,成熟树突棘的数量也与对照组无差异。说明在树（?）发育后期,经典Wnt信号通路通过NT3调节树突棘的形成与成熟。综上所述,本研究证实了经典Wnt信号通路通过NT3调节大鼠压后皮层L2神经元树突发育,调节树突发育的关键时间是E21至P7,这时的树突发育不依赖于神经活性;经典Wnt信号通路还可通过NT3调节大鼠压后皮层L2神经元树突棘的形成与成熟。这些结果有望为树突发育异常及RSC损伤所导致的神经发育失调、神经精神疾病等提供潜在的临床治疗靶点和策略。