颞下颌关节是口腔颌面部唯一的关节，也是人体唯一的联动关节，临床中由创伤、感染、肿瘤切除和先天畸形等导致的TMJ骨软骨缺损十分常见。当组织破坏至软骨下骨时，机体自身的修复过程很缓慢甚至不修复，目前主要通过骨组织移植或骨替代品植入的方法进行形态和功能修复。但由于供区组织有限、对供区造成二次损伤、移植物外形不匹配以及免疫排斥反应等使其应用受到限制。组织工程学的兴起为TMJ组织缺损的修复提供了一个新途径。 种子细胞的正确选择是目前组织工程动物实验及其过渡到临床的关键。目前组织工程中应用最广的成体干细胞是BMSCs，但存在纯化率较低、干细胞数量有限、对机体创伤较大、骨髓中干细胞的比例和增殖能力都会随年龄的增长和骨质疏松的发生而逐渐下降等缺点，因此探索组织工程新的种子细胞来源非常必要。脂肪组织是动物体内组成重要含量较多的组织，其再生能力强，自2001年Zuk等在脂肪组织中发现具有多向分化潜能的、成纤维细胞样的脂肪干细胞以来，相继在其他多个物种(包括人类)的研究表明其具有多向分化能力，因此它有望成为组织工程种子细胞的来源库。 小型猪脂肪沉积能力较强，近年来的研究也证明小型猪在遗传上较通常使用的其他实验动物如小鼠、大鼠、兔、狗等更接近于人类，而且皮下脂肪的分布同人类几乎相似，厚度大约0.5-1.0cm，体型较小，提抓方便，是研究脂肪干细胞及其他医学实验较为理想的动物模型。但是迄今为止，国内外关于小型猪ADSCs分离、培养和多向分化能力及骨软骨组织工程的报道较鲜见。基于以上原理和目的，本研究采用2-10月龄中国实验用I系小型猪为实验动物，采集颈部或背部脂肪组织通过I型胶原酶消化法分离并通过差速贴壁培养法培养．ADSCs并将其诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞，初步建立小型猪ADSCs的分离纯化方法及诱导条件；然后将细胞复合到双层支架中体外培养7天后植入小型猪背阔肌肌袋以预制髁状突样骨软骨组织，为进一步探索有效的途径以保证骨软骨组织移植到下颌骨部位能够进行形态和功能修复奠定理论基础。 第1章差速贴壁法体外分离培养小型猪ADSCs及其生物学特性的研究 目的：研究小型猪．ADSCs的分离纯化培养方法并研究其生物学特性，探讨差速贴壁法较传统消化贴壁法在细胞获取率及纯化方面的优点，为小型猪ADSCs的提取和纯化方法提供理论，为建立同人类相近的组织工程大型动物模型奠定理论基础并为临床应用提供实验依据。 材料和方法：从2-10月龄中国实验用I系小型猪颈部或背部无菌条件下获取皮下脂肪组织约10g，Ⅰ型胶原酶消化分离进行培养。培养4-6h倒置显微镜下观察，见少量细胞贴壁，立刻将含有未贴壁细胞的培养基接种到新培养瓶内继续培养，传统培养法不换培养瓶，两种方法获得的细胞均每3d换液一次。完全培养基传至第3代进行不同代数细胞贴壁时间的测定，同时使用流式细胞仪对第3代细胞行CD34、CD44和CD106等细胞表面抗原标志的检测；MTT法测定其生长活性并绘制细胞生长曲线。 结果：1.运用胶原酶消化和差速贴壁培养的方法可从小型猪颈部及背部脂肪组织分离培养获得ADSCs，现已传至45代。细胞形态观察、细胞贴壁时间、MTT法生长曲线结果表明此法获得的ADSCs在细胞形态学和生物学特性等方面都较传统贴壁法获得的ADSCs好；ADSCs在传代后经历游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和平台期。2.小型猪原代ADSCs 2d时呈多角形、短梭形等，5d以后呈长梭形，成纤维细胞样，集落生长，形态类似于人类和其他物种脂肪组织所分离培养获得的ADSCs。3.差速贴壁培养法可以除去部分贴壁的成纤维细胞、上皮细胞和脂滴，传代后培养瓶中脂滴明显减少，此法分离培养的ADSCs较传统方法培养的ADSCs更为纯化。4.流式细胞仪检测结果显示．ADSCs不表达造血干细胞标志CD34，间充质干细胞表面标志CD44表达阳性，而BMSCs表面标志CD106表达阴性。结论：采用差速贴壁法可从小型猪颈部皮下脂肪组织分离培养出ADSCs，可以表达干细胞表面抗原标志，生物学特性与BMSCs相似，形态学及生物学特性等方面较传统培养法获得的ADSCs较好，可以作为组织工程理想的种子细胞来源。 第2章小型猪ADSCs体外定向诱导分化的实验研究 目的：研究小型猪ADSCs在体外向脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞分化的能力，以鉴定ADSCs的多向分化能力，为骨软骨组织工程种子细胞新的来源提供依据。 材料和方法：从2-10月龄小型猪脂肪组织获取的ADSCs完全培养基传至第3代改换诱导培养基，向脂肪细胞诱导，培养2-4周，苏丹黑B、油红O鉴定向脂肪细胞分化的能力；分别向成骨、成软骨细胞诱导培养2-4周，ALP、Von kossa、茜素红染色鉴定向成骨细胞分化能力；阿新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定向软骨细胞分化的能力。 结果：1.小型猪ADSCs向成骨细胞诱导分化3d后，形态即发生改变，呈多角形或者不规则形，聚集生长为集簇状。2.小型猪ADSCs在体外向脂肪细胞诱导后，第7d即可看到胞质内有透明的脂滴形成，逐渐增多，苏丹黑B染色、油红O染色均呈阳性。3.ADSCs向成骨细胞诱导14d，细胞聚集生长形成钙化结节，Von kossa、茜素红染色均呈阳性，ALP活性检测结果说明有成骨基质的合成，表明ADSCs可分化为成骨细胞。4.ADSCs向软骨细胞诱导3d发生形态学改变，细胞变成多角形，成簇生长。诱导21d，阿新蓝染色阳性、Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：小型猪脂肪组织来源的ADSCs能够向脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞分化，具有多向分化能力，脂肪组织有望作为骨软骨组织工程理想的种子细胞来源。 第3章小型猪ADSCs复合磷酸四钙／壳聚糖双层支架的实验研究 目的：研究小型猪ADSCs在体外向成骨细胞、成软骨细胞分化后复合双层支架植入体内形成骨软骨复合组织的能力，初步研究双层支架材料同时培养骨软骨组织的可能性及其较单层支架复合单种种子细胞以及单纯支架的优越性，为骨软骨复合组织缺损的组织工程修复方法提供理论和实验依据。 材料和方法：分组情况：A．未处理组(空白对照组)；B．单层支架组(阴性对照组)；C．单层支架复合软骨细胞组(阳性对照组)；D．双层支架复合两种种子细胞组(实验组)。将支架称重、预湿，培养的第3代ADSCs向成骨、成软骨细胞诱导7-10d，消化离心，两种细胞以2×107／ml的浓度同时复合入磷酸四钙／壳聚糖双层支架材料，体外培养7d，4h、1d、3d、7d行电镜扫描观察细胞形态。将体外培养7d的细胞／支架复合体植入小型猪背阔肌肌袋内，术后3个月取材行称重、大体观察，并且利用光镜进行组织学检查，免疫组织化学染色，X线检查，ALP、阿尔新蓝染色等检查，以检测软骨基质和外周骨基质的生物学性状。 结果：1.术前各组支架质量无统计学差异。支架复合细胞后，电镜扫描结果显示4h细胞就可以贴壁，呈圆球状；1-3d细胞形态恢复正常，呈短梭形，开始生长；7d细胞形态较好。单层支架同双层支架体外培养结果无明显差别。2.肉眼观察对照组标本外有纤维组织包绕，呈暗红色：实验组标本表面光滑透亮，同软骨组织相似。称重结果比术前单纯支架质量增加约85％，不同组间支架质量有差别。3.组织学检查、X线检查和免疫组化等结果表明有类骨质和类软骨成分的生成，如钙盐和Ⅱ型胶原等；所有结果显示实验组比对照组骨软骨基质形成效果好。 结论：双层支架材料同时复合两种细胞对细胞的生物学行为几乎无影响,细胞可以正常生长，为体内移植做好准备，双层支架可以作为体外骨软骨组织工程的支架；双层支架同时复合两种细胞在背阔肌肌袋内能够较好的形成类骨软骨组织，为骨软骨组织缺损的修复带来新的希望，是骨软骨组织工程的良好方法。