PCR法测定食品中猪源性成分的研究

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随着社会经济的发展,人们饮食结构发生巨变的同时,食品行业也面临着越来越大的挑战。动物源性成分掺假事件等食品恶性违规事件对消费者健康以及市场经济造成了非常大的影响。为了能更好的对食品中动物源性成分掺假进行检测,保护消费者的健康和市场的稳定。本研究通过三种不同的方法对DNA进行提取,筛选出经济、快速、高质量的DNA提取方法,以满足后续PCR扩增。并通过荧光定量PCR和AFLP-PCR技术分别对食品中猪源性成分进行定量和定性检测,最后建立AFLP-PCR法对猪的不同品种进行鉴定,为食品中主猪源性成分检测提供技术依据,主要内容包括:(1)采用SDS法、异硫氰酸胍法和试剂盒法这三种方法提取动物肌肉组织DNA,对提取DNA的浓度和纯度进行了比较。并设计猪、牛、羊、鸡、草鱼的普通PCR引物进行普通PCR扩增,来验证三种方法所提取DNA的质量。结果显示,异硫氰酸胍法无需水浴加热,单个样品可以在30min内完成,所提取的DNAOD260/OD280比值为1.8左右,OD260/OD230的比值均大于2.0,异硫氰酸胍法所提取的生鲜及高压组织DNA浓度和纯度较高,且PCR扩增检测中产物条带完整清晰,完全满足对PCR扩增要求。(2)为建立肉制品中猪源性成分检测的PCR方法,以猪线粒体细胞色素B基因序列进行比对后,选取猪线粒体cytb种间保守区域,设计并合成猪特异性引物。以牛、羊、鸡、鸭DNA和不同浓度猪DNA进行SYBR Green荧光定量PCR反应,证明该引物具有物种特异性,检测低限可至5×10-5 ng/μL。并设计β-actin通用内参引物。构建含有0-100%的猪源性成分混合肉的标准曲线,2-ΔΔCt值与猪源性成分含量有显著的线性关系(R2=0.993),对猪源性成分含量0%-75%的混合肉样检测,回收率为100.51-105.36%。使用建立的PCR方法对六种市售样品进行检测,其中,在火腿肠中猪源性成分含量为4.69%。建立的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法操作简便、特异性强、所得数据可靠,为肉制品产品中猪源性成分检测提供了技术支持。(3)建立猪源性成分检测的AFLP-PCR方法。用EcoR I和Mse I两种限制性内切酶将猪基因组DNA进行双酶切并与接头连接,随后EcoR I-Mse I预扩增引物对进行预扩增。最后从64对选择性+3型Eco R I/Mse I引物中筛选出重复性好,条带数量少、条带清晰的E-ACC/M-CTT组合引物对用于区分猪源性成分,另筛选出4对重复性好、多态性较高的选择性扩增引物对不同品种猪进行鉴定。结果显示,在猪源性成分鉴定中,所筛选出的引物对可以很好地将牛、羊、鸡、鸭与猪区分开来。在生鲜肉中相似度最高的牛肉DNA与猪DNA相似度为51.7%,在高压肉中牛肉与猪肉DNA相似度为总75.1%。在灵敏度测试中,将猪DNA按照不同浓度分别添加在牛、羊、鸡、鸭生鲜和高压组织的DNA中,分析电泳图谱可知在生鲜和高压混合DNA中E-ACC/M-CTT组合引物对于检测猪源性成分的检测下限为0.1%。在品种区分中,这四对选择性扩增引物对共产生802个条带,平均每对引物产生200个条带,每对引物的识别概率为100%。所有样本均被分为两组,西班牙伊利比亚品种的平均相似系数为0.62,而太湖黑猪与藏香猪的平均遗传相似系数为0.72。此外,使用PLS-DA分析了不同对引物对3个猪品种的区分能力,结果与聚类分析结果一致。
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