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目的:黑素瘤(melanoma)是目前位于首位的致死性皮肤肿瘤,其发病率呈急速上升趋势,大多见于30岁以上的成年人,可发生于皮肤、黏膜和内脏器官。它是由于遗传因素、环境因素及其共同影响而引起的一种肿瘤,恶性程度极高,早期即可发生血液及淋巴道转移,而转移又是造成患者死亡的主要原因。随着近代医学分子水平的不断发展,人们更加希望通过精准化的治疗提高黑素瘤的治愈率及延长患者的生存期。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是调节血管生的最重要的细胞因子之一,尤其是对肿瘤的新生血管的调节及对肿瘤细胞发生转移的影响非常明显。实体肿瘤内新生血管的形成是其生长、转移及侵袭的重要结构和营养供需的基础。血管内皮生长因子主要通过与血管内皮细胞相应受体即血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)特异性结合,激活下游通路,促进肿瘤细胞的血管生成。在人类多种肿瘤中相继发现:不仅肿瘤血管内皮的细胞可以表达VEGF受体,肿瘤细胞中也有VEGF受体的表达,而这也是肿瘤细胞中VEGF自分泌机制发挥生物学作用的物质基础。VEGFR目前发现有3种:VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,VEGFR-2是最主要的功能受体,可与VEGF-A、C、D结合。VEGFR-2是最主要的功能受体,其与VEGF结合后可引发内皮细胞的一系列变化,促进肿瘤组织的血管生成、浸润和转移。越来越多的研究表明,VEGF及其受体在多种肿瘤中的表达含量增高:有数据显示在肺癌组织中VEGF及VEGFR2高表达并且与肺癌组织有无淋巴结转移、临床分期及肿瘤的分化程度密切相关,提示VEGF及VEGFR2在肺癌进展过程中发挥着重要作用;也有研究不断发现VEGF及其受体VEGFR2不但表达于血管内皮细胞,在卵巢癌细胞中也存在高表达;在大肠癌患者研究中发现VEGFR2可促进大肠腺癌的侵袭、生长和转移,并且vegfr2高表达的大肠癌患者预后不良。先前研究表明黑素瘤细胞高表达vegf并且高表达的vegf与黑素瘤发病及预后关系密切。而tas等人研究证实黑素瘤患者血浆中vegf水平明显升高,且vegf的表达水平与疾病发展阶段相关。人们越来越重视肿瘤血管生成在肿瘤的发生、发展、浸润、转移中发挥的作用,而抑制vegf,减少血管生成,切断肿瘤血供也成为治疗肿瘤的研究热点。灵芝属多孔菌科真菌灵芝的子实体,是一种非常珍贵的药食两用菌类,具有很高的医疗及营养价值,灵芝在中国已有几千年的药用历史,药物疗效与食用方法相关。服用后对身体有很多补益作用,可治疗神经衰弱、心律失常、高血压,补气活血安神,也可以防治慢性支气管炎等疾病。灵芝多糖(ganodermalucidumpolysaeeharides,gl-ps)是从灵芝中提取的其中的主要药效成分之一,具有增强免疫、抗机体氧化、降血糖及抗糖尿病并发症等作用。大量临床研究表明,灵芝多糖可通过调节免疫功能间接地抑制了肿瘤细胞的增生,也有研究显示灵芝多糖甚至能直接杀伤肿瘤细胞。本研究采用不同的浓度gl-ps作用于b16f10黑素瘤细胞,观察gl-ps对b16f10细胞分泌vegf及其受体vegfr2表达含量的影响,从而为黑素瘤的治疗提供新的方向。方法:1.细胞来源:本实验中使用的黑素瘤b16f10细胞来源于承德医学院附属医院中心实验室。2.实验分组及干预:根据培养基中含有的灵芝多糖的浓度进行分组,具体分为0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml共五个实验组,以仅添加rpmi-1640的完全培养基组作为空白对照组。3.采用realtimepcr(qrt-pcr)逆转录技术,检测vegf及vegfr2在不同浓度gl-ps处理后的b16f10细胞在基因转录水平的差异表达。4.采用蛋白印迹(western-blot)技术,检测vegf及vegfr2在不同浓度gl-ps处理后的b16f10细胞中蛋白水平的差异表达。5.采用免疫组化(immunohistochemistry)方法检测在不同浓度gl-ps处理后的各组b16f10细胞中vegf及vegfr2的表达差异。6.数据统计分析:应用spss21.0统计学分析软件对实验数据进行单因素方差分析,当p值小于0.05时,表示差异有统计学意义。结果:1.实验从基因水平检测GL-PS对小鼠黑素瘤细胞分泌血管内皮生长因子及其受体的抑制作用:在不同浓度GL-PS作用下,常规培养B16F10黑素瘤细胞至汇合状态,采用RT-PCR技术检测,结果显示:用GL-PS处理B16F10后,VEGF的基因表达水平分别为:1.28±0.16,1.13±0.09,0.97±0.08,0.88±0.06,0.75±0.14;VEGFR2的基因表达水平分别为:1.01±0.06,1.11±0.09,0.8±0.059,0.71±0.03,0.43±0.02;随着GL-PS浓度的不断增高,B16F10细胞中VEGF及VEGFR2蛋白水平的表达呈降低趋势,经单因素方差分析,差异有显著性((VEGF:F=7.006,P<0.05;VEGFR2:F=48.033,P<0.005)。2.实验从蛋白水平检测GL-PS对小鼠黑素瘤细胞分泌血管内皮生长因子及其受体的抑制作用:在不同GL-PS作用下,采用western-blot技术检测,结果显示:用GL-PS处理B16F10后,VEGF的蛋白表达水平分别为:1.63±0.47,1.77±0.16,0.74±0.07,0.82±0.07,0.41±0.10;VEGFR2的蛋白表达水平分别为:2.16±0.11,1.97±0.07,1.51±0.06,1.35±0.09,1.04±0.16;实验结果表明,随着GL-PS浓度的不断增高,B16F10细胞中VEGF及VEGFR2蛋白水平的表达呈降低趋势,经单因素方差分析,差异有显著性(VEGF:F=19.931,P<0.005;VEGFR2:F=57.155,P<0.005)。3.采用免疫组化法进一步检测了不同浓度GL-PS处理下VEGF及VEGFR2的表达。对照组B16F10黑素瘤细胞VEGF及VEGFR2的阳性表达呈棕黄色,而用GL-PS处理后的实验组B16F10中VEGF及VEGFR2阳性表达低于对照组,并且结果呈现随浓度的增高而降低趋势。结论:1.灵芝多糖能够抑制小鼠黑素瘤细胞分泌血管内皮生长因子及其受体