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第一章脂质PLGA纳米微泡的制备和表征目的:制备一种可被骨髓间充质干细胞内吞且具有较好生物相容性的新型硬壳超声造影剂——脂质PLGA纳米微泡(以下简称为脂质PLGA纳泡,Lipid PLGA nanobubbles,LPNs),以实现动物体内较长时间的稳定超声成像。方法:以高分子材料PLGA和脂质为成膜材料,采用双乳化法制备脂质PLGA纳泡。扫描电镜和透射电镜分析脂质PLGA纳泡的形态学表征,动态光散射(DLS)技术测量脂质PLGA纳泡的平均直径和尺寸分布,超声成像仪检测单纯脂质PLGA纳泡的超声成像性能。结果:扫描电镜显示脂质PLGA纳泡具有高分散性和完整的球形外观,透射电镜显示脂质PLGA纳泡的核心为较大的空气内腔,DLS检测结果显示脂质PLGA纳泡的平均直径是(467.3±19.49)nm,且脂质PLGA纳泡在体外随着纳泡浓度的增加,超声造影信号强度也随之增强,两者具有线性相关性(R2=0.99)。结论:本研究成功制备了脂质PLGA纳泡,其具有形态规则,粒径均一的特性,并可产生稳定、较强的超声对比增强信号,声学成像性能良好,是一种具有良好前景的新型超声造影剂。第二章脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞的构建及其体内外超声成像示踪目的:本研究拟通过脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),观察脂质PLGA纳泡对BMSCs细胞增殖的影响,评价脂质PLGA纳泡超声标记示踪BMSCs的效能。旨在制备一种具有实时超声成像功能的标记干细胞,从而提供一种基于实时超声成像实现干细胞示踪的新策略,为潜在的机制研究和干细胞治疗的未来临床应用奠定基础。方法:1、通过全骨髓贴壁培养法,从大鼠肱骨及尺、桡骨内提取和培养了大鼠骨髓间充质干细胞。2、将大鼠骨髓间充质干细胞与浓度分别为50μg/ml,l00μg/ml,200μg/ml,500μg/ml,l000μg/ml,2000μg/ml的脂质PLGA纳泡共孵育6小时,用荧光共聚焦显微镜检测骨髓间充质干细胞对脂质PLGA纳泡的内吞效能,再以CCK-8细胞毒性实验与体外超声成像能力、荧光共聚焦显微镜检测相结合,筛选出内吞效果最好、超声成像效果最佳且不影响细胞活性的最佳材料共孵育浓度。3、将2×106个脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞皮下注射于裸鼠背部,注射前后观察目标区域的超声显像情况,验证脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞在动物皮下是否具有成像能力。将2×106个标记的骨髓间充质干细胞原位注射入裸鼠C6皮下瘤实质内,分别于不同时间点(0、1、5天)观察其超声成像情况。4、分别将100μPBS重悬的2×1 03,2×1 04,2×1 05个脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞皮下注射至裸鼠背部并进行超声成像,检测标记干细胞的最低可探测限值。结果:1、通过全骨髓贴壁培养法提取、培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长的梭形细胞,具有骨髓间充质干细胞生物学特点。2、CCK-8实验表明,不同浓度脂质PLGA纳泡与骨髓间充质干细胞共孵育的结果与对照组(不含脂质PLGA纳泡)相比,细胞毒性无显著差异(p>0.05),说明脂质PLGA纳泡对骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。但随着共孵育脂质PLGA纳泡浓度的增加,超声造影信号强度在500μg/ml后不再呈线性增加,说明500μg/ml为骨髓间充质干细胞内吞脂质PLGA纳泡浓度的上限,因此,我们使用500μg/ml作为该脂质PLGA纳泡标记干细胞超声成像实验的材料浓度。3、该脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞在体外超声仿体中可维持5天较强的超声造影能力。在动物皮下及皮下胶质瘤实质内部原位注射该脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞,于超声二维及造影模式下均可见较强超声造影信号,且在裸鼠C6皮下瘤实质内也可实现连续5天超声成像监测。4、进一步研究发现,在动物肿瘤的体内超声检测下限为2000个脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞。结论:脂质PLGA纳泡可有效标记骨髓间充质干细胞,标记过程不影响细胞的生物学活性。被脂质PLGA纳泡标记的骨髓间充质干细胞可以产生较强的超声对比增强信号,可防止干细胞治疗时的注射失误确保足够的细胞递送到目标治疗位置,达到辅助增强干细胞的治疗效果,并且可实现较长时间的干细胞超声实时追踪成像。