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目的：
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，伴随社会老龄化不断增长，发病率也呈现逐年上涨的趋势，临床治疗中主要以化学治疗为主，而顺铂又是化学治疗中的重要药物之一，但在使用顺铂的治疗过程中极其容易产生耐药性，这也成为了顺铂治疗失败的关键问题。因此，研究肺癌顺铂耐药机制成为现今肺癌治疗的热点问题之一。
近年来，表观遗传学与化学药物敏感性的研究逐渐成为热点。长链非编码RNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，其在基因沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等具有重要功能，与多种疾病的发展息息相关，其异常表达与肿瘤的形成、浸润、转移过程相关。研究表明lncRNA与顺铂耐药密切相关，但其具体的相关耐药机制并不是非常明确。
Long non-coding RNA（lncRNA）RP11-838N2.3作为一个新的lncRNA分子，目前在肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LAD）顺铂耐药中的作用机制尚不清楚。本次实验旨在分析RP11-838N2.3在肺腺癌顺铂耐药中的表达，并初步探讨其在肺腺癌顺铂耐药中的生物学功能及作用，以期为肺腺癌顺铂耐药治疗提供新的靶点。
方法：
1.细胞培养人肺腺癌A549和A549/DDP细胞株购置于中国科学院上海细胞库，添加RPMI1640培养基置于37℃，5％的二氧化碳培养。观察到细胞生长状态良好，并且以70％至90％的密度进行细胞传代。
2.肺腺癌组织样本收集收集温州医科大学附属第一医院2010年至2015年LAD患者癌组织57例；另外收集顺铂治疗敏感（完全缓解+部分缓解）25例，顺铂治疗不敏感（进展）32例，并收集所有病人的相关临床和病理资料，以上LAD患者均经病理学确诊。所有组织标本切除后立即保存在液氮中。
3.总RNA提取应用Trizol法提取组织细胞和细胞株的总RNA。
4.高通量基因芯片分析应用基因芯片检测A549/DDP的差异性表达lncRNA，筛选出差异明显的lncRNA。
5.RT-PCR分析采用RT-PCR检测细胞株及组织标本的的lncRNA RP11-838N2.3表达量。
6.过表达载体构建及转染利用慢病毒介导技术构建RP11-838N2.3的过表达载体，并转染A549细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测感染前后RP11-838N2.3表达量的变化。
7.shRNA干扰载体构建及转染利用慢病毒介导技术构建基因干扰RP11-838N2.3的shRNA干扰RNA，并转染A549/DDP细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测感染前后RP11-838N2.3表达量的变化。
8.顺铂药物干预根据A549细胞（A549OE-NC组）、基因过表达A549细胞（A549OE组）、A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA-NC组）、基因干扰A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA组）的IC50值，在2ug/ml顺铂药物浓度下置于37℃，5%C02孵箱中培养48h后，获得顺铂药物作用下的A549细胞（A549OE-NC+2ug/ml cisplatin组）、基因过表达A549细胞（A549OE+2ug/ml cisplatin组）、A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA-NC+2ug/ml cisplatin组）、基因干扰A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA+2ug/ml cisplatin组）。
9.细胞增殖能力检测接种细胞于96孔板，37℃，5%CO2培养。分别感染第ld、3d、5d和7d，向每孔加入10ul CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
10.细胞迁移能力检测在6孔板背后划横线，每孔加入约5X105个细胞培养24h后，用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基，放入37℃5%CO2培养箱培养，按0h、24h、42h、78h取样，拍照。
11.细胞侵袭能力检测每个小室铺Matrigel胶后，用胰酶消化细胞并制成单个细胞悬液，加入到侵袭小室内，培养24h后，弃去小室内培养液，用PBS洗2遍，甲醇固定20min（或用95%酒精固定10min），0.1%结晶紫染色15-20min，清水洗3遍以上，200×显微镜下计数10个视野，并拍照。用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其吸光度值。
12.细胞周期和细胞凋亡检测将细胞用70%冰乙醇固定，4℃放置过夜。上机前用PBS重悬细胞，37℃温育30min，然后加入0.1mg/ml碘化丙啶进行细胞染色10min。用流式细胞仪测试细胞DNA含量，结果分析采用phoenix软件。
13.统计学分析多组间数据比较，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料采用Kruskal-Wallis检验。两两数据比较，正态分布资料采用t检验，非正态分布资料采用Mann-Whitney U检验。利用SPSS18.0软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.RP11-838N2.3在A549/DDP中的高通量基因芯片分析A549/DDP细胞的高通量芯片结果显示共检测出差异性表达lncRNA共1643条，其中上调lncRNA1030条，下调lncRNA613条，Change fold>=2.0者被认为存在差异表达。RP11-838N2.3为表达明显上调的lncRNA（芯片change fold=66.056595）。
2.RP11-838N2.3在细胞株和组织标本中的表达水平A549/DDP细胞RP11-838N2.3表达水平明显高于A549细胞(P＜0.05)；肺腺癌组织RP11-838N2.3表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.05)，淋巴结转移组表达水平明显高于淋巴结未转移组(P＜0.05)；顺铂治疗不敏感的肺腺癌细胞RP11-838N2.3表达水平也明显高于顺铂治疗敏感的肺腺癌细胞(P＜0.05)。
3.RP11-838N2.3对细胞增殖的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达后IC50明显增加，OD450值在转染后第24h、第48h和第72h显著增加,RP11-838N2.3基因干扰后IC50明显降低，OD450值在转染后第24h、第48h和第72h显著降低，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
4.RP11-838N2.3对细胞迁移的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达迁移率在转染后第24h、第48h和第72h显著增加，RP11-838N2.3基因干扰迁移率在转染后第24h、第48h和第72h显著降低，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
5.RP11-838N2.3对细胞侵袭的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达侵袭率显著增加，RP11-838N2.3基因干扰侵袭率显著降低，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
6.RP11-838N2.3对细胞周期的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达和基因干扰后细胞周期的各期细胞比例均无显著性差异(P＞0.05)。
7.RP11-838N2.3对细胞凋亡的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达细胞凋亡率显著下降，RP11-838N2.3基因干扰细胞凋亡率显著上升，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
结论：
1.RP11-838N2.3在肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞中明显上调。
2.RP11-838N2.3可增强肺腺癌顺铂耐药细胞的IC50、增殖、迁移、侵袭能力、抑制其凋亡能力。
3.RP11-838N2.3可增强肺腺癌细胞的顺铂耐药性，故其为耐药性lncRNA分子。
肺癌是全球癌症死亡的首要原因，伴随社会老龄化不断增长，发病率也呈现逐年上涨的趋势，临床治疗中主要以化学治疗为主，而顺铂又是化学治疗中的重要药物之一，但在使用顺铂的治疗过程中极其容易产生耐药性，这也成为了顺铂治疗失败的关键问题。因此，研究肺癌顺铂耐药机制成为现今肺癌治疗的热点问题之一。
近年来，表观遗传学与化学药物敏感性的研究逐渐成为热点。长链非编码RNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，其在基因沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等具有重要功能，与多种疾病的发展息息相关，其异常表达与肿瘤的形成、浸润、转移过程相关。研究表明lncRNA与顺铂耐药密切相关，但其具体的相关耐药机制并不是非常明确。
Long non-coding RNA（lncRNA）RP11-838N2.3作为一个新的lncRNA分子，目前在肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LAD）顺铂耐药中的作用机制尚不清楚。本次实验旨在分析RP11-838N2.3在肺腺癌顺铂耐药中的表达，并初步探讨其在肺腺癌顺铂耐药中的生物学功能及作用，以期为肺腺癌顺铂耐药治疗提供新的靶点。
方法：
1.细胞培养人肺腺癌A549和A549/DDP细胞株购置于中国科学院上海细胞库，添加RPMI1640培养基置于37℃，5％的二氧化碳培养。观察到细胞生长状态良好，并且以70％至90％的密度进行细胞传代。
2.肺腺癌组织样本收集收集温州医科大学附属第一医院2010年至2015年LAD患者癌组织57例；另外收集顺铂治疗敏感（完全缓解+部分缓解）25例，顺铂治疗不敏感（进展）32例，并收集所有病人的相关临床和病理资料，以上LAD患者均经病理学确诊。所有组织标本切除后立即保存在液氮中。
3.总RNA提取应用Trizol法提取组织细胞和细胞株的总RNA。
4.高通量基因芯片分析应用基因芯片检测A549/DDP的差异性表达lncRNA，筛选出差异明显的lncRNA。
5.RT-PCR分析采用RT-PCR检测细胞株及组织标本的的lncRNA RP11-838N2.3表达量。
6.过表达载体构建及转染利用慢病毒介导技术构建RP11-838N2.3的过表达载体，并转染A549细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测感染前后RP11-838N2.3表达量的变化。
7.shRNA干扰载体构建及转染利用慢病毒介导技术构建基因干扰RP11-838N2.3的shRNA干扰RNA，并转染A549/DDP细胞，采用实时荧光定量RT-PCR检测感染前后RP11-838N2.3表达量的变化。
8.顺铂药物干预根据A549细胞（A549OE-NC组）、基因过表达A549细胞（A549OE组）、A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA-NC组）、基因干扰A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA组）的IC50值，在2ug/ml顺铂药物浓度下置于37℃，5%C02孵箱中培养48h后，获得顺铂药物作用下的A549细胞（A549OE-NC+2ug/ml cisplatin组）、基因过表达A549细胞（A549OE+2ug/ml cisplatin组）、A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA-NC+2ug/ml cisplatin组）、基因干扰A549/DDP细胞（A549/DDP shRNA+2ug/ml cisplatin组）。
9.细胞增殖能力检测接种细胞于96孔板，37℃，5%CO2培养。分别感染第ld、3d、5d和7d，向每孔加入10ul CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
10.细胞迁移能力检测在6孔板背后划横线，每孔加入约5X105个细胞培养24h后，用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基，放入37℃5%CO2培养箱培养，按0h、24h、42h、78h取样，拍照。
11.细胞侵袭能力检测每个小室铺Matrigel胶后，用胰酶消化细胞并制成单个细胞悬液，加入到侵袭小室内，培养24h后，弃去小室内培养液，用PBS洗2遍，甲醇固定20min（或用95%酒精固定10min），0.1%结晶紫染色15-20min，清水洗3遍以上，200×显微镜下计数10个视野，并拍照。用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其吸光度值。
12.细胞周期和细胞凋亡检测将细胞用70%冰乙醇固定，4℃放置过夜。上机前用PBS重悬细胞，37℃温育30min，然后加入0.1mg/ml碘化丙啶进行细胞染色10min。用流式细胞仪测试细胞DNA含量，结果分析采用phoenix软件。
13.统计学分析多组间数据比较，正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料采用Kruskal-Wallis检验。两两数据比较，正态分布资料采用t检验，非正态分布资料采用Mann-Whitney U检验。利用SPSS18.0软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.RP11-838N2.3在A549/DDP中的高通量基因芯片分析A549/DDP细胞的高通量芯片结果显示共检测出差异性表达lncRNA共1643条，其中上调lncRNA1030条，下调lncRNA613条，Change fold>=2.0者被认为存在差异表达。RP11-838N2.3为表达明显上调的lncRNA（芯片change fold=66.056595）。
2.RP11-838N2.3在细胞株和组织标本中的表达水平A549/DDP细胞RP11-838N2.3表达水平明显高于A549细胞(P＜0.05)；肺腺癌组织RP11-838N2.3表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.05)，淋巴结转移组表达水平明显高于淋巴结未转移组(P＜0.05)；顺铂治疗不敏感的肺腺癌细胞RP11-838N2.3表达水平也明显高于顺铂治疗敏感的肺腺癌细胞(P＜0.05)。
3.RP11-838N2.3对细胞增殖的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达后IC50明显增加，OD450值在转染后第24h、第48h和第72h显著增加,RP11-838N2.3基因干扰后IC50明显降低，OD450值在转染后第24h、第48h和第72h显著降低，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
4.RP11-838N2.3对细胞迁移的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达迁移率在转染后第24h、第48h和第72h显著增加，RP11-838N2.3基因干扰迁移率在转染后第24h、第48h和第72h显著降低，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
5.RP11-838N2.3对细胞侵袭的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达侵袭率显著增加，RP11-838N2.3基因干扰侵袭率显著降低，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
6.RP11-838N2.3对细胞周期的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达和基因干扰后细胞周期的各期细胞比例均无显著性差异(P＞0.05)。
7.RP11-838N2.3对细胞凋亡的影响与对照组相比，RP11-838N2.3过表达细胞凋亡率显著下降，RP11-838N2.3基因干扰细胞凋亡率显著上升，在顺铂作用下也是同样的趋势(P＜0.05)。
结论：
1.RP11-838N2.3在肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞中明显上调。
2.RP11-838N2.3可增强肺腺癌顺铂耐药细胞的IC50、增殖、迁移、侵袭能力、抑制其凋亡能力。
3.RP11-838N2.3可增强肺腺癌细胞的顺铂耐药性，故其为耐药性lncRNA分子。