人源化CD52单克隆抗体(Campath-1H)对表达CD52抗原的T、B淋巴细胞、单核细胞、NK细胞等具有强大的清除作用,最初用于治疗慢性淋巴细胞白血病、多发性硬化等疾病,近年来常用于肾移植、肝移植、小肠移植等实体器官移植中诱导产生免疫耐受。虽然Campath-1H应用于器官移植已十余年,但缺少适宜的动物模型评价其在器官移植中的安全性和有效性,因此限制了其在器官移植中的进一步应用。Campath-1H只与非人灵长类动物中的某些种属具有交叉反应,而不能识别啮齿类动物细胞上的抗原。非人灵长类动物在亲缘关系上与人最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。在临床移植中应用Campath-1H诱导方案后,可清除移植病人外周血中99%以上的淋巴细胞,并维持很长一段时间低淋巴细胞水平状态。肠道中的淋巴细胞数量比外周组织中的多,肠道是全身最大的免疫器官。目前国内外对Campath-1H的研究多集中于对外周血淋巴细胞的清除作用,尚缺乏对肠道淋巴细胞作用的研究。本研究中,我们采用食蟹猴作为动物模型,给予Campath-1H处理后,观察给药后不同时间食蟹猴外周血、脾脏、淋巴结淋巴细胞的变化,肠道上皮内及固有层淋巴细胞数量及亚群的变化,以及肠道粘膜地址素细胞粘附分子与淋巴细胞归巢受体的相互关系。研究Campath-1H对淋巴细胞的清除作用及归巢机制,为临床小肠移植中更好的应用Campath-1H提供实验依据。第一部分动物模型的建立及人源化CD52单克隆抗体对食蟹猴外周血、脾脏、淋巴结淋巴细胞的作用目的:人源化CD52单克隆抗体运用于器官移植已十余年,但缺少适宜的动物模型评价其在器官移植中的安全性和有效性,限制了其在器官移植中的进一步应用。本实验首先建立人源化CD52单克隆抗体诱导食蟹猴动物模型,并观察其对食蟹猴外周血、脾脏、淋巴结淋巴细胞的作用。方法:雄性食蟹猴,3-5岁龄,体重3-5.5 kg,使用流式细胞仪筛选红细胞表面不表达CD52抗原的食蟹猴,将筛选出的食蟹猴随机分为实验组和对照组,实验组按3 mg/kg给予静脉滴注Campath-1H,对照组给予等量生理盐水。分别于给药后9、14、35、56天处死实验组动物取材,给药组中的第56天处死的3只食蟹猴分别于第3、6、9、14、21、35、56天取外周血进行淋巴细胞计数及流式细胞仪分析淋巴细胞亚群,观察给药前后不同时间血中淋巴细胞数量变化情况。数据采用SPSS 13.0统计软件作单因素方差分析(ANOVA,LSD),两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有显著性统计学意义。结果:从40只食蟹猴中筛选出15只红细胞表面不表达CD52抗原的食蟹猴,筛选出的与未被筛选出的食蟹猴在血液生理和生化指标方面无显著性差异。给药后食蟹猴血中单核细胞、淋巴细胞呈现出快速被清除及恢复的过程,单核细胞在给药后第6天降至最低点,T、B淋巴细胞在给药后第9天降至最低点。单核细胞在给药后第14天恢复至给药前水平,CD20+B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞分别在给药后21、35、56天恢复至给药前水平。给药后第9天,脾脏淋巴细胞、淋巴结淋巴细胞减少,给药后第35天,淋巴细胞数量逐渐增多,给药后第56天,脾脏、淋巴结组织形态恢复至给药前水平。结论:成功建立人源化CD52单克隆抗体诱导食蟹猴动物模型。应用Campath-1H后食蟹猴外周血中淋巴细胞清除效果强大,并逐渐恢复,脾脏、淋巴结淋巴细胞均呈现清除与恢复的过程。本实验模型可用于人源化CD52单克隆抗体临床前移植模型的研究。第二部分人源化CD52单克隆抗体对食蟹猴肠道淋巴细胞的作用目的:观察应用人源化CD52单克隆抗体后,食蟹猴肠道上皮内及固有层淋巴细胞的变化,评价该抗体对食蟹猴肠道淋巴细胞的作用,以及食蟹猴肠道粘膜地址素细胞粘附分子与淋巴细胞归巢受体的变化,研究两者相互关系。方法:雄性食蟹猴,3-5岁龄,体重3-5.5 kg,红细胞表面不表达CD52抗原15只,随机分为实验组和对照组,实验组按3mg/kg给予静脉滴注Campath-1H,对照组给予等量生理盐水。分别于给药后9、14、35、56天处死实验组动物取材,切取长约10 cm小肠,分离上皮内及固有层淋巴细胞,进行计数、流式细胞仪分析淋巴细胞亚群。取近回盲部回肠组织,进行病理、免疫荧光染色检查。采用RIPA法提取肠粘膜总蛋白,进行Western Blot检测肠粘膜MAdCAM-1蛋白的表达变化。流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞β7整合素变化情况。数据采用SPSS 13.0统计软件作单因素方差分析(ANOVA,LSD),P<0.05为差异有显著性统计学意义。结果:给药后第9天肠道IEL、LPL数量降至最低点,给药后14天仍处于低水平,给药后第35天数量逐渐增加,至给药后第56天恢复至给药前水平。免疫荧光染色证实了上述变化。给药后第14天,肠道IEL、LPL亚群发生改变,IEL中CD4-CD8+、TCRαβ+T淋巴细胞比例显著降低,而CD4+CD8+T淋巴细胞比例显著升高;LPL中CD3-CD20+B淋巴细胞、TCRyδ+T淋巴细胞比例显著降低,而CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+T淋巴细胞比例显著升高。给药后第56天,肠道IEL、LPL各亚群比例恢复至给药前水平。病理结果显示对照组回肠粘膜完整,绒毛呈柱状,高度正常,给药后第9天回肠绒毛萎缩,高度变短,上皮细胞形态紊乱,有脱落,至给药后第56天回肠绒毛高度恢复正常,粘膜完整,上皮细胞排列整齐。Western Blot检测表明给药后第9天肠粘膜MAdCAM-1蛋白减少,给药后14天仍处于低水平,给药后第35天恢复至给药前水平。免疫荧光染色证实了上述变化。给药后第9天外周血T淋巴细胞β7整合素表达比例增高,给药后14天仍处于较高水平,给药后第35天恢复至给药前水平。结论:Campath-1H对肠道IEL、LPL具有清除作用,同时对其亚群也产生影响。肠道MAdCAM-1表达的变化与外周血T淋巴细胞α4β7整合素表达的变化趋势有相关性。在食蟹猴模型上,α4β7整合素与MAdCAM-1的特异性结合,可能是肠道淋巴细胞归巢的机制之一。