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血吸虫病(schistosomiasis)是由血吸虫感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。目前,以化学药物吡喹酮对血吸虫病进行治疗是血吸虫病防控采用的最主要措施,但吡喹酮不能避免重复感染,且近年来曼氏血吸虫已有吡喹酮抗性虫株的报道。因此,加强血吸虫病疫苗候选分子的筛选和疫苗的研制开发将是血吸虫病防治的重大需求。糖酵解途径是血吸虫能量代谢最重要途径之一。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解途径的关键酶,该酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱。作者从大鼠、小鼠来源10d童虫差异表达基因以及日本血吸虫体被表膜蛋白的研究基础上,选择SjPGK基因开展了以下研究：1日本血吸虫磷酸甘油酸激酶SjPGK的克隆和表达分析克隆了日本血吸虫SjPGK基因,生物信息学分析表明该基因全长1398bp,其中ORF为1251bp,编码416个氨基酸,理论分子量为44382.21Daltons,理论等电点为6.57, SjPGK和SmPGK氨基酸序列的相似性为94%。以看家基因Tublin为内参,应用荧光实时定量PCR技术分析了SjPGK基因在日本血吸虫7d、14d、21d、28d、35d虫体和42d雌雄虫体内的表达情况,结果表明,SjPGK基因在日本血吸虫虫体的各个阶段均有转录,其中在21d虫体内表达量最高,雄虫的表达量明显高于雌虫,在血吸虫适应性宿主小鼠来源的虫体中表达量高于非适应性宿主大鼠来源虫体。成功构建了pET-28a-SjPGK重组原核表达质粒,通过优化表达条件使重组蛋白在E.coli(DE3)中呈可溶性表达,分子量为44KDa, Western blotting分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。2日本血吸虫重组蛋白pET-28a-SjPGK酶学活性研究日本血吸虫SjPGK重组蛋白以1,3-二磷酸甘油酸和ATP为底物,与3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联,通过检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的吸光度来检测重组蛋白酶活力。酶动力学研究表明重组蛋白的比活力为125U/mg,相对于底物3-PGA的米氏常数Km值为2.69mmol/L,相对于底物ATP的米氏常数Km值为1.51mmol/L,当pH在8-9之间,温度在30-35℃之间,该重组蛋白酶活性最高。3小鼠免疫保护试验及SjPGK蛋白的组织定位用纯化的pET-28a-SjPGK重组蛋白与206佐剂结合免疫BALB/c小鼠,与对照组相比,免疫小鼠获得了34.5%的减虫率(P<0.05)和32.2%的减卵率(P>0.05)。用ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平及IgG1和IgG2a抗体亚型的变化,结果表明,在第一次免疫后抗重组蛋白特异性IgG. IgGl和IgG2a抗体迅速产生且一直维持在一个较高的水平。这可能与重组蛋白在小鼠体内诱导部分免疫保护作用有关。利用荧光免疫技术观察SjPGK蛋白在日本血吸虫7d、21d、28d、35d虫体及42d雌雄中的表达定位,结果显示,PGK蛋白在日本血吸虫的各个虫体均有表达,主要分布在体被表膜上。提取日本血吸虫42d虫体体被表膜蛋白,Western blotting结果显示,在44KD处呈现一阳性反应条带,证实SjPGK蛋白大量存在血吸虫的体被表膜中。本研究为深入研究SjPGK基因的生物学功能奠定了基础,为筛选新的血吸虫病疫苗候选分子提供了新思路。