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目的：了解河北省手足口病(HFMD)不同病原的流行特征,明确其病原谱及主要病原的基因特征,为河北省手足口病的监测和预防控制工作提供科学依据。方法：1通过流行病学调查,采集HFMD临床诊断病例的粪便、肛拭子、咽拭子、疱疹液和脑脊液标本。2针对肠道病毒(EV)5’端非编码区保守基因序列以及EV VP1至2A区基因序列设计EV通用引物和型特异性引物,通过RT-PCR扩增检测HFMD临床诊断病例的标本,并对病原进行分型。3将RT-PCR检测为EV阳性的HFMD实验室诊断病例标本接种RD细胞分离病毒；通过RT-PCR法对出现细胞病变(CPE)的标本进行毒株鉴定。4针对主要病原EV71和CA16的VP1区全核苷酸序列设计引物,用RT-PCR扩增18株EV71、9株CA1 6的VP1区,测定其序列,用DNASTAR软件进行核苷酸序列同源性分析并构建系统发生树,对河北省EV71和CA16分离株的基因亚型进行分析。结果：1采用RT-PCR法共检测HFMD临床诊断病例1990份标本,1296份标本EV阳性,阳性率为65.13%,其中752份标本EV71阳性,阳性检出率为37.79%；452份CA16阳性,阳性检出率为22.71%；1份EV71+CA16阳性,阳性检出率为0.05%；91份其他EV阳性,阳性检出率为4.57%。病原构成结果显示,HFMD病原以EV71为主,占阳性病例的58.03%(752/1296),次之是CA16,占阳性病例的34.88%(452/1296),其他EV占一定比例,占阳性病例的7.02%(91/1296)。随机抽取55份其他EV阳性标本(42份普通病例、13份重症病例),进一步分析上述其他EV中病原的构成情况。经RT-PCR和测序进一步分型,除24份未定型外,共鉴定出31份,从构成情况看,CA10占18.18%(10/55),CA6占14.55%(8/55),31份,从构成情况看,CA10占18.18%(10/55),CA6占14.55%(8/55),EC030占9.09%(5/55),EC06、EC09各占3.64%(2/55),CA5、CA14、CB5、ECO14各占1.82%(1/55),未定型占43.64%(24/55)。结果提示,其他EV中病原构成复杂,涉及多种病毒,本次试验共检出9种,但主要以CA10、CA6、ECO30为主。2从不同地区的病原构成情况看,秦皇岛、邯郸、保定、邢台地区EV71所占比例较高,分别为77.53%、76.18%、69.12%、65.98%；衡水、沧州地区CA16所占比较高,分别为64.29%、51.28%；沧州地区其他EV所占比例相对较高,为313.33%。对55份其他EV阳性标本进一步分型显示,除廊坊、邢台、秦皇岛未分出型别外,其他地区均存在一种或一种以上的其他型别。沧州地区11份标本中,6份为CA10阳性,1份为EC030阳性；石家庄地区其他EV型别种类较多,13份标本中共检出7种其他型别,分别为CA5、CA6、CA10、CA14阳性各1份,ECO6、ECO9阳性各2份,EC030阳性3份；邯郸地区7份标本中共检出4种型别,分别为CA6、CA10、ECO30、ECO14阳性各1份。但仍有24份未分出型别。病原构成显示,沧州地区CA10所占比例较高,为54.55%(7/11),石家庄地区EC030所占比例较高,为23.08%(3/13)。3不同疾病状态病原构成情况检测普通病例1230例,阳性689例,阳性率56.02%,其中EV71阳性260例,占37.74%；CA1 6阳性362例,占52.54%；其他EV 67例,占9.72%,三者之比约为3.9：5.4：1。对42份其他EV进一步分型显示,CA 1 0占19.05%(8/42),CA6占1 6.67%(7/42),EC030占7.14%(3/42),EC09占4.76%(2/42),CA5、CB5、CA14、ECO14各占2.88%(1/42),未分型占42.86%(18/42)。检测重症病例747例,阳性594例,阳性率79.52%,其中EV71+CA16阳性1例,占0.17%(1/594)；EV71阳性479例,占80.64%(479/594)；CA16阳性90例,占15.15%(90/594)；其他EV 24例,占4.04%(24/594),后三者之比约为20：3.8：1。对13例其他EV进一步分型显示,ECO6、ECO30、CA10各占15.38%(2/13),CA6占7.69%(1/13),未分型占46.15%(6/13)。检测死亡病例13例,均为EV71阳性。4共检测粪便标本141份,101份EV阳性,阳性率为71.63%；肛拭子标本617份,514份EV阳性,阳性率为83.31%；疱疹液标本90份,53份EV阳性,阳性率为58.89%；咽拭子标本1141份,628份EV阳性,阳性率为55.04%；脑脊液1份,未检出病毒核酸。5将RT-PCR检测为EV阳性的160份标本接种RD细胞,进行病毒分离,共分离到毒株57株,分离率为35.63%。经RT-PCR和测序鉴定,其中32株为EV71,9株为CA16,8株为CA16+EV71,6株为CA10,1株为CA6,1株为CA5。其中粪便标本接种17份,分离9份,分离率为52.94%；肛拭子标本接种42份,分离15份,分离率为35.71%；疱疹液标本接种11份,分离3份,分离率为27.27%；咽拭子标本接种89份,分离30份,分离率为33.71%；脑脊液标本接种1份,未分离到病毒。6 18株EV71分离株之间VP1区核苷酸同源性94.4%～99.8%,与全国10个省市分离株的VP1区核苷酸同源性在94.5%～99.6%之间,与A、B基因型代表株VP1区同源性差异较大,核苷酸同源性只在81.7%～82.7%、83.2%～85.1%之间,而与C基因型代表株比较接近,核苷酸同源性在86.6%～99.6%之间,与C1、C2、C3、C4、C5亚型代表株的VP1区核苷酸同源性分别在89%～90.1%、88.1%～90.2%、88%～89.2%、91.9%～99.6%、86.6%～88.2%之间。7 9株CA16分离株间VP1区核苷酸同源性高达91.4%～99.9%,与A基因型代表株核苷酸同源性较低,为75.4%～77%,与33株B基因型代表株比较接近,核苷酸同源性在88.6%～99%之间。8 EV71和CA16分离株基因分型及系统进化树分析表明,河北省EV71分离株为C4亚型的C4a进化分支,CA16分离株属于B基因型。9 16株EV71分离株在亚型相关表位的氨基酸组合模式为KADSTV,其余2株为KANSTV和KADSIV组合模式。10 17株EV71分离株在VPl区抗原性表位高度保守,共同序列为EIDLP-LEGTTNPNGYA,但2009-hebei-SJZ-120F第93位氨基酸由缬氨酸取代了异亮氨酸(Ⅰ-Ⅴ)。结论：1 2009年引起河北省手足口病流行的病原体主要为EV71和CA16,同时还有部分CA5、CA6、CA10、CA14、CB5、ECO6、ECO9、ECO14、EC030等其他型别,引起河北省重症病例的EV主要型别为EV71。2EV71、CA16毒株基因分型及系统进化树分析表明,河北省EV71分离株为C4亚型C4a进化分支,CA16为B基因型。3 EV71分离株在6个亚型相关位点的主要氨基酸组合模式为KADST-V,还有KANSTV和KADSIV组合模式,为KADSTI类似模式的补充模式。4绝大部分EV71分离株在主要免疫表位高度保守,其氨基酸序列为EIDLPLEGTTNPNGYA。5 CA16分离株中发现两个有意义的突变位点,对抗原的空间构象可能会产生一定的影响。