论文部分内容阅读
目的本课题旨在探索miR-128-3p在肝癌中的表达、功能及其相关分子机制,并分析其临床意义。方法 本研究一方面通过qRT-PCR法检测miR-128-3p在肝癌组织和肝癌细胞的表达水平,并分析miR-128-3p表达量与肝癌患者临床病理特征和预后的相关性；另一方面,通过瞬时转染建立人肝癌细胞过表达：miR-128-3p模型,采用CCK-8和克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的增殖和克隆形成能力,采用流式细胞术、Transwell法检测肝癌细胞的周期和迁移能力；机制方面,通过生物信息学手段预测miR-128-3p的靶基因,分别从mRNA和蛋白水平验证miR-128-3p对靶基因及其相关信号通路的影响；并且,组织学进一步检测靶基因和miR-128-3p的相关性,从而更深一层揭示miR-128-3p影响肝癌生物学功能的分子机制。结果 (1)通过对72对肝癌组织进行qRT-PCR发现,65.30%(47/72对)的肝癌组织显示miR-128-3p低表达；同时检测本实验拥有的QGY-7703, SK-hep1, QGY-7404, SMMC-7721, Huh7, HepG26种肝癌细胞系,也发现miR-128-3p的表达均远低于HL-7702的表达(P<0.05)。(2)通过统计学方法分析miR-128-3p表达水平与临床病理特征及预后的关系。结果显示,miR-128-3p的表达水平与患者的肿瘤大小和TNM分期相关(P<0.05),与其他因素如性别、年龄、HBV、肝硬化等无关。另外,生存分析结果表明：低表达miR-128-3p的患者与短的术后生存期(Postoperative survival)明显相关(P<0.05)。(3)为了进一步分析miR-128-3p在肝癌中的生物学功能,我们通过重构肝癌细胞的miR-128-3p表达水平,然后观察肝癌细胞增殖和集落形成情况。结果发现过表达miR-128-3p确实能抑制肝癌细胞的生长和集落形成；而且流式细胞仪检测细胞周期还发现,miR-128-3p能诱导肝癌细胞阻滞在G0/G1期。同时,Transwell小室检测结果也表明过表达miR-128-3p能抑制肝癌细胞的迁移运动能力。以上结果表明,miR-128-3p具有抑癌基因的作用,参与肝癌的发生发展。(4)为了进一步分析miR-128-3p抑制肝癌的分子机制,我们通过生物信息学软件进行靶点预测,qRT-PCR和Western blot进行靶点验证,发现PIK3R1是miR-128-3p的一个靶点。并且采用Western blot检测miR-128-3p对PIK3R1 (p85a)相关的PI3K-AKT信号通路中的关键蛋白AKT、mTOR、 p70S6K的影响,结果均显示,过表达miR-128-3p,能抑制肝癌细胞内的AKT、mTOR、p70S6K的磷酸化水平。为了进一步验证组织中miR-128-3p与PIK3R1的相互关系,我们再次通过qRT-PCR法检测肝癌组织中PIK3R1的表达水平,结果发现,PIK3R1在68.06%(49 of 72)的肝癌组织中表达水平显著高于癌旁组织；同时采用Pearson相关系数分析miR-128-3p与PIK3R1的表达的相关性,也发现PIK3R1的表达与miR-128-3p的表达水平呈负相关。这说明在肝癌患者体内,miR-128-3p的下调可能减弱了对PIK3R1表达的抑制作用。结论miR-128-3p在肝癌中普遍低表达,miR-128-3p的表达量与肝癌患者预后相关；niR-128-3p可通过调控PIK3R1的表达,从而抑制PI3K/AKT信号通路的激活,最终实现其对肝癌细胞增殖和迁移的抑制作用。本研究结果为肝癌的治疗提供了一个潜在的靶点。