论文部分内容阅读
目的:ω-3脂肪酸脱氢酶(Fat-1基因)能够催化ω-6 PUFAs生成ω-3 PUFAs,后者中的EPA和DHA对胎儿的大脑和视神经发育起着至关重要的作用,同时在治疗老年痴呆症、心脑血管疾病、癌症以及精神疾病等方面有着一定的效果,而ω-6 PUFAs却与癌症的发生关联密切。人体内Fat-1基因的缺乏以及饮食中ω-3 PUFAs分布不均匀,导致体内ω-6 PUFAs严重堆积,使得ω-6/ω-3的比值远远超过1:1的理想状态,因此必须通过合理膳食来补充人体对ω-3 PUFAs的需求。植物中含有的α亚麻酸可以合成EPA和DHA,但合成效率极低,人类也可以通过摄食海产品来获得ω-3PUFAs,但这样一来成本过高,二来也容易在体内积累海洋污染物质。本研究的目的,就是通过对来源于秀丽线虫的Fat-1基因进行改造,使其能够在鸡体细胞内高效表达,同时有效地将ω-6转化为ω-3,优化ω-6/ω-3比例,在此基础上,利用转基因技术获得肉中富含ω-3 PUFAs的转基因鸡。方法:1.Fat-1基因密码子的优化、表达载体构建以及转基因活性分析胰酶消化法获得鸡胚胎成纤维细胞;根据鸡密码子使用频率,对秀丽隐杆线虫Fat-1基因序列进行优化合成;将改造后的Fat-1基因(c Fat-1)连接至p LL3.7表达载体,构建重组质粒p LL3.7-c Fat-1;经PCR、酶切、序列分析等手段对重组载体进行鉴定;利用Turbo Fect转染试剂将p LL3.7-c Fat-1转染体外培养的成纤维细胞;通过对被转染细胞中目的基因的RT-PCR检测和绿色荧光观察,分析c Fat-1基因在细胞中的表达;然后以气相色谱分析转染后细胞中的脂肪酸成分和含量。2.转基因鸡的生成(1)胚盘下腔显微注射法:于新鲜未孵化种蛋的赤道最高处开口,暴露胚盘,胚盘中央明区注射2μL重组质粒,保鲜膜封口,常规条件孵化;(2)外周血管显微注射法:将孵化至13~15期的鸡胚移入新的备用蛋壳,胚胎血管中注射外源质粒,保鲜膜封口后小角度翻蛋孵化。收集不同孵化时期的胚胎,提取组织DNA、RNA以及脂肪酸,随后进行冰冻切片检测;再对阳性个体的组织进行PCR、RT-PCR以及气相色谱检测分析。结果:重组载体经序列比对,发现优化后序列编码氨基酸与Fat-1基因一致;c Fat-1基因在鸡成纤维细胞中高效表达,成功构建了可在鸡体内表达c Fat-1基因的特异性表达载体;转基因细胞系中ω-3 PUFAs的含量从2.33522增升至5.21512,而ω-6 PUFAs减低了1.3倍左右,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比例从4.7降低到1.7;血管注射法获得的转基因鸡的肝脏、胸肌、腿肌等组织的冰冻切片中检测到荧光信号,PCR、RT-PCR结果也证实了外源基因的表达;肌肉脂肪酸分析发现,转基因阳性个体胸肌组织中ω-3 PUFAs的含量明显升高,且ω-6 PUFAs与ω-3 PUFAs之比从对照组的5.1下降至2.2。结论:本研究成功构建了适合在鸡体内表达的真核表达载体p LL3.7-c Fat-1;转染p LL3.7-c Fat-1的鸡成纤维细胞能高效表达外源基因,并能有效地将ω-6 PUFAs转化为ω-3 PUFAs;再以显微注射法产生转基因阳性个体,色谱分析结果证明转基因个体能够表达ω-3脂肪酸脱氢酶,胸肌中ω-6/ω-3的比值显著下降。