山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)是山梨醇转化为糖原的关键酶,家蚕卵中山梨醇含量的变化与卵期滞育的发动、持续和停止有着密切的平行关系。家蚕有3个SDH基因,分别为BmSDH-1、BmSDH-2a和BmSDH-2b。虽然有不少有关家蚕山梨醇脱氢酶的研究报道,但他们研究重点主要集中在蛋白酶的表达上,并未发现有对这3个SDH基因启动子特性进行研究的相关文献。为了探究BmSDH是如何参与调控二化性家蚕滞育的分子机制,本文对家蚕二化性品种“秋丰”3个SDH基因相同长度启动子,BmSDH-2a不同长度启动子以及激素对BmSDH-2a启动子活性影响进行了研究分析,取得如下主要结果。1.家蚕体内山梨醇脱氢酶活性主要来自BmSDH-2a的表达根据家蚕3个山梨醇脱氢酶基因所在的核苷酸序列,设计特异性引物,以二化性(bivoltine,bvt)品种秋丰基因组DNA为模板,PCR扩增得到3个BmSDH约1.0Kb的启动子片段;以pGL3.0 basic质粒为载体,分别构建由BmSDH启动子片段驱动荧光素酶报告基因(luc)表达载体pGL3-BmSDH-1-bvt-1074,pGL3-BmSDH-2a-bvt-1082和pGL3-BmSDH-2b-bvt-1175;分别转染家蚕卵巢来源的BmN细胞,以转染空载的BmN细胞为对照,分析luc表达水平,并以此衡量BmSDH启动子片段的活性,结果显示:同样长度的BmSDH-2a启动子活性明显高于BmSDH-2b和BmSDH-1的启动子活性,分别是后者的9.7倍和21.0倍,暗示家蚕体内山梨醇脱氢酶活性主要来自BmSDH-2a的表达。2.BmSDH-2a基因启动子-355-1082bp之间存在负调控元件为了进一步研究BmSDH-2a基因启动子的特性,从BmSDH-2a基因启动子的5’端截短处理,分别克隆二化性品种BmSDH-2a 674 bp和355 bp的启动子片段,构建不同长度的BmSDH-2a启动子片段控制的报告质粒pGL3-BmSDH-2a-bvt-674和pGL3-BmSDH-2a-bvt-355,并与pGL3-BmSDH-2a-bvt-1082分别转染BmN细胞,结果显示:BmSDH-2a的355bp启动子活性明显高于674 bp和1082bp的启动子,分别是它们的1.3倍和3.3倍,提示在BmSDH-2a启动子-355 bp~-674 bp和-674 bp~-1082bp之间存在负调控元件。3.不同的昆虫激素对BmSDH-2a基因启动子活性的影响存在差异以长度为1082bp的BmSDH-2a基因启动子驱动的荧光素酶报告质粒转染BmN细胞,并分别在培养基中添加滞育激素、保幼激素和蜕皮激素,结果发现:当使用不同浓度滞育激素进行处理的时,BmSDH-2a基因启动子的活性与滞育激素浓度为0时的活性并没有显著变化,说明滞育激素不能直接调节BmSDH的表达;当保幼激素浓度为2,4,6μg/mL时,启动子的活性显著降低,分别是浓度为0时的0.67,0.64和0.67倍;当保幼激素浓度为1μg/mL时,启动子的活性变化不显著,说明高浓度的JH抑制了BmSDH的表达;蜕皮激素浓度为1μg/mL时,启动子的活性显著降低,是浓度为0时的0.63倍;而浓度为2,4,6μg/mL的条件下,启动子活性极显著减弱,是浓度为0时的0.22,0.17,0.16倍,说明高浓度蜕皮激素也抑制了BmSDH的表达。上述研究结果为研究BmSDH的功能积累了实验数据,也有助于阐明家蚕滞于分子机制。