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产蛋性状是鸡的重要经济性状之一,其产蛋性能的优劣主要取决于鸡卵巢组织等级卵泡的募集数量、优势选择、等级化建立和卵泡成熟等,影响卵泡生长发育的因素有很多,其中除了受到下丘脑-垂体-性腺轴(HPG axis)所分泌的FSH、LH等激素的调节外,还受到转化生长因子-β超家族(TGF-β)和表皮生长因子家族(EGF)等的调节,此外还受到某些信号通路及其成员分子的影响。本实验室的前期研究已证明,MST1、MST2、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1是构成鸡Hippo/MST信号通路的核心成员,同时也证明鸡Hippo/MST信号通路能够抑制其等级前卵泡的生长发育。揭示Hippo/MST信号通路各主要成员在鸡优势卵泡选择和等级化建立过程的作用,为深入研究卵泡发育规律,解析促进等级前优势卵泡选择与等级化建立的调控原理提供理论依据;也为深入发掘控制鸡产蛋性状的关键基因,开展以提高产蛋性状和饲料转化率为育种目标的地方鸡种资源遗传改良和杂种优势利用奠定分子基础,具有十分重要的科学意义和应用前景。然而,作为LATS1同源蛋白的LATS2在鸡卵巢等级前卵泡生长发育的调控作用及其分子调控的研究目前尚未见到相关报道。本研究以150日龄海兰褐蛋鸡为实验材料,利用相对定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR、基因过表达、siRNA干扰、Western blotting和EDU检测等方法分别从mRNA转录水平和细胞水平深入探究LATS2基因表达变化对Hippo/MST信号通路其上游基因(MST1、MST2和SAV1)、其下游基因(YAP1、TEAD1和TEAD3)以及效应器YAP1分子的潜在靶基因——等级前卵泡颗粒细胞增殖生物标记侯选基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)的mRNA表达的影响,进而解析LATS2基因与它们之间的相互促抑调控关系及其对等级前卵泡颗粒细胞增殖的生物学功能,从而揭示鸡LATS2基因调控卵巢等级前卵泡生长发育的作用及其功能研究。主要实验与结果如下:1.LATS2及Hippo/MST信号通路上下游基因mRNA在卵泡中的表达特性本实验利用相对定量RT-PCR方法检测150日龄海兰褐蛋鸡卵巢间质和不同直径卵泡中MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因mRNA的表达水平,然后进行灰度值分析。结果显示,MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因mRNA在卵巢间质和不同直径卵泡中均有表达,并且其在等级前卵泡的整体mRNA相对表达量显著高于等级卵泡的整体mRNA相对表达量(P﹤0.05)。由此说明MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因与鸡卵泡的生长发育密切相关,但具体的调控机制还需要以下实验进行检验。2.过表达LAST2基因对Hippo/MST信号通路其上游基因(MST1、MST2和SAV1)、其下游基因(YAP1、TEAD1和TEAD3)以及等级前卵泡颗粒细胞增殖生物标记侯选基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)的mRNA表达的影响和对等级前卵泡颗粒细胞增殖的调控作用本实验通过载体构建与转染、相对定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR、Western blotting等方法以及EDU试剂盒进行检测。结果显示,过表达LATS2基因后MST1、MST2、TEAD1和TEAD3基因的mRNA表达水平显著上调(P﹤0.05),SAV1和YAP1基因的mRNA表达水平显著下调(P﹤0.05);而生物标记候选基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)mRNA表达水平显著下调(P﹤0.05),同时EDU检测鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖显著减少(P﹤0.05)。说明过表达LATS2基因对MST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有促进作用,对SAV1和YAP1具有抑制作用,同时抑制鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖,进而说明LATS2基因对鸡等级前卵泡的生长发育具有调控作用,为了验证此结果的可信度,我们还需要进行下一步验证。3.siRNA干扰LAST2基因对Hippo/MST信号通路其上游基因(MST1、MST2和SAV1)、其下游基因(YAP1、TEAD1和TEAD3)以及等级前卵泡颗粒细胞增殖生物标记侯选基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)的mRNA表达的影响和对等级前卵泡颗粒细胞增殖的调控作用本实验通过将干扰片段siRNA-LATS2转染至鸡等级前颗粒细胞(4-8 mm)中,再利用相对定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR、Western blotting以及EDU试剂盒进行检测。结果显示siRNA干扰LATS2基因后MST1、MST2、TEAD1和TEAD3基因的mRNA表达水平显著下调(P﹤0.05),SAV1和YAP1基因的mRNA表达水平显著上调(P﹤0.05),而生物标记候选基因(FSHR、STAR、CYP11A1、ESR1和ESR2)mRNA表达水平均显著上调(P﹤0.05),同时鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖显著(P﹤0.05),这与LATS2过表达实验结果恰好相反。siRNA干扰LATS2基因对MST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有抑制作用,对SAV1和YAP1具有促进作用,同时促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖。综合实验2和实验3的结果表明LATS2基因对MST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有促进作用,对SAV1和YAP1具有抑制作用,同时对鸡等级前卵泡的生长发育具有抑制作用。4.ESR1和ESR2基因SNPs的检测及其与产蛋性状间的关联分析因为ESR1和ESR2在实验2和3中mRNA表达变化能够影响鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖与分化,同时大骨鸡是优良的蛋肉兼用型地方鸡种,本实验为深入发掘控制鸡产蛋性状的关键基因,并以提高产蛋性状和饲料转化率为育种目标的地方鸡种资源遗传改良和杂种优势利用奠定基础,故利用PCR-SSCP和DNA测序分析技术筛选ESR1和ESR2基因与大骨鸡产蛋性状相关联的SNP位点。结果显示,在ESR1基因外显子4上发生T1101C的转换,ESR2基因外显子8上发生G1755A的转换,其中ESR1和ESR2基因的TT和GG纯合基因型个体在30、43、57、66周龄的产蛋量显著高于CT和GA杂合基因型个体的产蛋量(P﹤0.05),而CT和GA杂合基因型个体在30周龄的蛋重显著高于TT和GG纯合基因型个体的蛋重(P﹤0.05)。根据两个SNPs组合可以得到4种组合基因型,其中TTGG组合基因型个体在30、43、57、66周龄的产蛋量显著高于TTGA、CTGG和CTGA组合基因型个体的产蛋量,CTGA组合基因型个体在30和43周龄的体重显著高于TTGG组合基因型个体的体重,CTGA组合基因型个体在30和43周龄的蛋重显著高于TTGG和TTGA组合基因型个体的蛋重。并且这两个SNPs在大骨鸡产蛋性状中的遗传方差百分比相对较高(P﹥1%)。本研究明确了MST1、MST2、LATS2、YAP1、TEAD1和TEAD3基因mRNA在卵巢间质和不同直径卵泡中均有表达,并且各个基因mRNA的最高表达量均出现在等级前卵泡中,与等级卵泡的mRNA表达水平有显著差异(P﹤0.05);揭示了LATS2基因对MST1、MST2、TEAD1和TEAD3具有促进作用,对SAV1和YAP1具有抑制作用;证明了LATS2基因能够抑制海兰褐蛋鸡等级前卵泡的生长发育;同时明确了ESR1和ESR2的SNP位点T1101C和G1755A与大骨鸡的产蛋性状具有显著关联性(P﹤0.05)。本研究揭示了LATS2基因调控鸡等级前卵泡生长发育的作用,进一步完善了鸡卵泡发育的调控网络;同时为更深入地研究鸡Hippo/MST信号通路调控等级前卵泡的作用机制奠定基础,为鸡卵泡优势选择和等级化建立的遗传机理提供理论依据;也为开展以提高产蛋性状和饲料转化率为育种目的的地方鸡种资源遗传改良和杂种优势利用奠定分子基础,具有十分重要的科学意义和应用前景。