论文部分内容阅读
背景:N-myc下游调节基因(N-myc downstream-regulated gene,NDRG)是近年发现的一族新基因,因其在N-myc敲除小鼠胚胎组织中表达上调而被命名,NDRG2为4个家族成员之一。我们以及他人对NDRG2研究的结果提示其功能的多样性,但具体的作用机制尚不清楚。当前对NDRG2功能的研究主要集中在其作为抑癌候选基因的角色,而有限的研究信息提示NDRG2可能与软骨发育必须的促成熟与分化调节因子骨形态发生蛋白4(Bone morphogenetic protein4,BMP4)相关。目的:以小鼠肢芽发育模型和大鼠骨关节炎(Osteoarthritis,OA)模型作为研究对象,对比研究NDRG2与BMP4的表达模式,探讨两者可能的相关性。方法:解剖获取不同胎龄小鼠的肢芽,制备组织连续切片,苏木素-伊红(H&E)和番红-O固绿染色,建立不同胎龄小鼠肢芽发育模型;采用免疫组织化学方法比较NDRG2和BMP4蛋白在不同胎龄小鼠肢芽中的分布模式;采用实时荧光定量PCR(real time PCR)检测NDRG2、BMP2、BMP4、Sox9和Runx2 m RNA在不同胎龄小鼠肢芽中的表达趋势;采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测NDRG2和BMP4蛋白在不同胎龄小鼠肢芽中的表达趋势。建立SD大鼠骨关节炎(OA)模型:右膝关节腔单次注射碘乙酸钠(Monosodium iodoacetate,MIA)溶液50μL(含2 mg MIA),生理盐水(NS)作为对照组;造模后,采用动物行为学观察、关节软骨大体观察和评分、H&E和番红-O固绿染色组织病理学观察和评分,评定大鼠骨关节炎(OA)建模;采用免疫组织化学方法检测NDRG2和BMP4蛋白在正常成年大鼠和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨以及软骨下组织的表达分布。结果:解剖显微镜下大体观察:小鼠胚胎肢体以肢芽的形式在胚体躯干部的侧面出现,随着胎龄的增长,肢体沿长轴方向迅速生长,趾间蹼逐渐消失,最终形成完整清晰的肢体结构;不同胎龄小鼠肢芽连续切片经H&E和番红O-固绿染色后,能清楚看到肢体软骨内成骨的发育过程;免疫组织化学结果显示:NDRG2和BMP4蛋白在肢芽表达分布的区域较为相似,随着增殖型软骨细胞向肥大软骨细胞发展过程中表达逐渐升高,尤其在前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞的胞浆中表达最为显著,随着四肢骨的发育NDRG2蛋白在增殖软骨细胞区和前肥大软骨细胞区的表达高于BMP4蛋白的表达,而BMP4蛋白在肥大软骨细胞中的的表达高于NDRG2蛋白;Real time PCR结果显示:胎龄E11.5肢芽中NDRG2和Runx2 m RNA表达水平较低,而BMP4和Sox9相对较高,随着肢芽的发育NDRG2、BMP2、BMP4、Sox9和Runx2基因表达水平均呈现增高趋势,以NDRG2和Runx2增高最为显著;Western Blotting结果显示:NDRG2和BMP4蛋白表达水平随着肢芽的发育均呈现增高趋势。关节腔注射MIA后,大鼠出现精神萎靡、活动量减少、触碰有躲避行为,膝关节外观肿胀,关节软骨表面有肉眼可见的粗糙、缺损和溃疡形成,关节软骨大体损伤评分显著高于NS对照组(P<0.01);大鼠膝关节组织连续切片H&E和番红O-固绿染色结果显示:MIA造模组有软骨剥脱和缺损,软骨受损区有排列紊乱的纤维覆盖,软骨细胞排列紊乱数量明显减少,软骨基质番红O着色面积明显减小且不均匀,受损区域严重失染,MIA组Mankin评分明显高于NS对照组(P<0.01),说明关节腔单次注射2 mg MIA 4周成功建立了OA模型;免疫组织化学结果显示:正常成年大鼠,无论是关节软骨中的软骨细胞还是骨骺生长板中的软骨细胞,均未见BMP4蛋白阳性染色,而在软骨下的骨组织中BMP4蛋白阳性染色较为显著,与BMP4蛋白不同的是,NDRG2蛋白阳性染色在关节软骨中层区域的软骨细胞的胞浆中较为显著,在软骨下的骨组织中有轻度阳性染色,与BMP4蛋白相同的是,NDRG2蛋白在骨骺生长板中的软骨细胞亦未见阳性染色;OA大鼠免疫组织化学结果显示:在关节软骨受损区域,BMP4蛋白阳性染色较为显著,尤其在软骨受损区的关节表层以及排列紊乱的纤维组织中,与之相反,NDRG2蛋白阳性染色在关节软骨受损区域变浅甚至消失。结论:NDRG2与BMP4共同参与了软骨发育、关节软骨稳态的维持和关节软骨损伤的形成。NDRG2和BMP4在软骨生理和病理中相关性的证实,不仅为理解软骨发育和关节软骨稳态维持的调控机制增添了新的内容,也为关节软骨损伤修复提供了新的思路。