【摘 要】
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本文采用了丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原,以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutam
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本文采用了丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原,以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG),PCR产物连接到pMD18-T克隆载体后亚克隆到表达载体pET-22b(+),转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。重组大肠杆菌加IPTG诱导后,转谷氨酰胺酶酶原(pro-TG)主要以可溶性蛋白表达。菌体离心后用丙酮高速搅拌破碎细胞,亲和层析成功地纯化到了转谷氨酰胺酶酶原。转谷氨酰胺酶酶原经胰蛋白酶切割激活后获得了较高的酶活,其中粗体酶活为7.6U/mL,采用BSA交联实验证实成熟的转谷氨酰胺酶(TG)具有功能。然后重点构建pHT43-pro-TG和pBEP43-pro-TG载体探讨在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800中表达pro-TG的情况,仍以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到转谷氨胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG),将pro-TG的PCR产物经pMD-T载体亚克隆到表达载pHT43(+)和pBEP43(+)中,分别命名为pHT43-pro-TG和pBEP43-pro-TG,转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800中。所获得的含pBEP43-pro-TG的转化子,经32小时恒温发酵成功地获得了pro-TG的蛋白质分泌表达产物,BSA(Bovine Serium Albumin,牛血清蛋白)交联实验表明所得蛋白产物具有转谷氨胺酶活性,胰蛋白酶切割激活后粗提酶活测定为0.21U/mL,亲和层析纯化酶活为2.02U/mL。本实验实现了转谷氨酰胺酶的胞外分泌表达,对深入研究转谷氨酰胺酶的工业应用具有重要意义。
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