目的：自噬(autophagy)是细胞在饥饿或应激状态下，对细胞内大分子物质和细胞器进行降解和再利用的过程。众所周知，细胞生命活动所需要的ATP主要来自线粒体，那么线粒体作为细胞内的一种重要细胞器在细胞的生理活动过程中起着非常重要的作用。线粒体损伤是许多人类疾病的直接诱因,而线粒体自噬是细胞清除体内损伤线粒体以及维持自身稳态的一种重要的调节机制。有研究表明，若细胞内损伤及老化线粒体的聚集可能是由于细胞自噬缺陷引起的，细胞自噬缺陷会进一步促进肿瘤的发展。肿瘤的发生发展与线粒体自噬的缺陷或激活有着密切的联系。但线粒体自噬在肿瘤细胞自噬中的作用及其调控机制还尚未完全明了。拓扑替康（Topotecan,TPT）是一种DNA损伤类抗癌药物，属于半合成、水溶性的喜树碱类似物，能特异性地抑制细胞核内的拓扑异构酶Ⅰ的活性。ATM是DNA损伤的直接感应因子。前期的研究中，我们发现拓扑替康（Topotecan,TPT）可引起肿瘤细胞内ATM、Beclin1的磷酸化水平升高，且伴随线粒体自噬的发生，提示ATM、Beclin1可能与线粒体自噬存在某种关系。因此本文主要探讨Beclin1参与调控TPT（拓扑替康）诱导的ATM磷酸化进而影响线粒体自噬及其分子机制，阐明Beclin1在DNA损伤类抗癌药物介导的肿瘤细胞线粒体自噬中的作用。方法：体外培养的细胞株如下：A549株即人非小细胞肺癌细胞、GLC-82株即人肺腺癌细胞、HeLa株即人宫颈癌细胞株、Hep3B株即人肝癌细胞。用免疫荧光技术检测GFP-LC3的点状聚集及线粒体自噬的形成情况；phospho-ATM、LC3、P62、phospho-Beclin-1T57蛋白的表达采用Western bloting的方法检测；Ku55933（ATM特异性抑制剂）和RNAi-ATM抑制ATM的活性后免疫荧光技术检测线粒体自噬的形成情况；用免疫共沉淀法检测Caspase-8、RIP1、FLIP与ATG5结合情况，并采用MTT法检测不同条件下TPT对肿瘤细胞的抑制作用。结果：1. TPT（拓扑替康）可以诱导肿瘤细胞自噬Western blotting方法检测发现LC3I型向II型转变逐渐增强，P62的表达逐渐减弱，并且成浓度依赖性，免疫荧光结果显示TPT（拓扑替康）可以诱导肿瘤细胞GFP-LC3发生点状聚集。由此说明TPT可以诱导肿瘤细胞发生自噬。2. TPT（拓扑替康）可以诱导肿瘤细胞线粒体自噬，同时激活ATM免疫荧光检测发现当TPT（拓扑替康）作用肿瘤细胞24h时，Hep3B细胞核内出现大量粗颗粒的γ-H2AX聚集点，说明TPT（拓扑替康）可引起肿瘤细胞DNA损伤。不同浓度TPT（拓扑替康）处理肿瘤细胞后TOM20出现核周聚集。0.6μg/ml TPT（拓扑替康）处理肿瘤细胞不同时间，当处理24h时TOM20出现核周聚集，随着作用时间的延长到48h时TOM20核周聚集恢复正常。当TPT（拓扑替康）处理肿瘤细胞24h时线粒体出现核周聚集，与此同时MitoTracker标记的线粒体与LC3、LAMP2共定位，随着作用时间的延长，当TPT（拓扑替康）作用于肿瘤细胞48h时TOM20核周聚集恢复正常。由此说明肿瘤细胞可能通过自噬来清除损伤线粒体,从而维持细胞稳态。3. TPT（拓扑替康）通过ATM磷酸化从而诱导肿瘤的自噬及线粒体自噬的发生Western blotting方法检测发现phospho-ATM的表达逐渐增强，且呈时间浓度依赖性。用shATM干扰ATM的表达或者使用ATM特异性抑制剂Ku55933抑制ATM的活性，TPT（拓扑替康）处理发现ATM、phospho-ATM的表达减弱，LC3I型向II型转变减弱，P62的表达有所增强。免疫荧光技术检测当TPT（拓扑替康）处理shATM干扰ATM的表达或者使用ATM特异性抑制剂Ku55933抑制ATM的活性，TPT（拓扑替康）作用24h时TOM20出现核周聚集随着作用时间的延长到48h时TOM20核周聚集不能恢复正常。由此说明，ATM是影响TOM20核周聚集及核周聚集恢复正常的重要因素。4. TPT（拓扑替康）可以诱导Beclin1T57磷酸化用Scansite软件预测ATM可能磷酸化Beclin1第57位苏氨酸，并针对Beclin1第57位制备了特异性的磷酸化抗体，并进一步通过Western blotting验证了抗体的有效性。另外我们发现TPT（拓扑替康）可以促使Beclin1-T57发生磷酸化，并且这种磷酸化的发生呈现明显的浓度、时间依赖性。5. Beclin1-T57是TPT（拓扑替康）诱导肿瘤细胞ATM磷酸化的下游靶点用ATM特异性抑制剂Ku55933抑制ATM的活性，Western blotting方法检测发现ATM的活性明显被抑制，Beclin1的表达基本不变，phospho-Beclin1-T57、phospho-ATM的表达明显减弱。由此说明Beclin1-T57可能参与调控TPT（拓扑替康）诱导的ATM磷酸化进而影响线粒体自噬的发生。为了验证上述推测我们做了以下实验，用sh-ATM将ATM沉默后，Western blotting方法检测发现phospho-Beclin1-T57、phospho-ATM的表达明显减弱。由此说明Beclin1-T57可能是TPT（拓扑替康）诱导ATM磷酸化的下游靶点。免疫共沉淀结果显示Beclin1与ATM直接结合，且当Beclin1的第57位突变后影响Beclin1、ATM的结合。为此我们得出结论Beclin1-T57是TPT（拓扑替康）诱导ATM磷酸化的下游靶点。6.ATM可能通过调控Beclin1T57磷酸化从而影响TPT（拓扑替康）诱导的线粒体自噬及细胞的生存状态免疫荧光结果显示用siBeclin1将Beclin1沉默后，TPT（拓扑替康）作用于GLC-8224h时TOM20出现核周聚集，作用时间的延长到48h，TOM20核周聚集不恢复正常。由此说明，Beclin1是影响线粒体自噬的重要因素。接着我们用已经构建好的稳定细胞株GLC-82-Beclin1-WT、GLC-82-Beclin1-T57A，Western blotting结果显示，TPT处理稳转株后发现Beclin1-T57影响LC3-II的表达。免疫荧光结果显示TPT（拓扑替康）作用24h时GLC-82-Beclin1-WT、GLC-82-Beclin1-T57A的TOM20均出现核周聚集，但随着作用时间的延长到48h时，GLC-82-Beclin1-WT组TOM20核周聚集恢复正常，GLC-82-Beclin1-T57A组TOM20核周聚集不恢复正常。由此说明，Beclin1-T57是影响线粒体自噬的重要因素。接着我们用MTT法检测不同浓度的TPT（拓扑替康）处理Beclin1沉默前后，及GLC-82-Beclin1-WT、GLC-82-Beclin1-T57A稳转株的细胞死亡的影响，结果显示将Beclin1沉默后A549、GLC-82细胞的增殖抑制率明显降低，同样Beclin1第57位氨基酸突变后肿瘤细胞的增殖抑制率明显降低。这一结果提示我们Beclin1-T57在TPT（拓扑替康）诱导的细胞自噬和细胞死亡中发挥关键作用。为此我们得出结论Beclin1-T57磷酸化参与调控TPT（拓扑替康）诱导的ATM磷酸化进而影响线粒体自噬及细胞死亡过程中发挥关键作用。7.线粒体自噬激活caspase-8促进其与自噬前体复合物结合从而促进细胞死亡Western blotting结果显示，0.6μg/ml TPT（拓扑替康）处理肿瘤细胞0-48h，48h时Caspase-8出现明显的断裂带，即此时Caspase-8被激活。不同浓度的TPT处理肿瘤细胞48h后，Caspase-8同样被激活。免疫共沉淀结果显示，0.6μg/ml TPT（拓扑替康）处理肿瘤细胞24h后Caspase-8、RIP1能够与ATG5结合，当加入3-Methyladenine（hVps34抑制剂，能特异性抑制自噬）时三者的结合被逆转。RIP1的抑制剂Necrotatin-1或自噬特异性抑制剂3-MA与TPT联用时，MTT法分别检测肿瘤细胞的死亡作用，发现单独使用Necrotatin-1或者3-MA、TPT对肿瘤细胞有一定的抑制率，当Necrotatin-1或者3-MA和TPT联和应用时抑制率降低。结论：1. TPT（拓扑替康）可诱导肿瘤细胞细胞自噬及线粒体自噬，同时激活ATM磷酸化且呈浓度、时间依赖性。2. TPT（拓扑替康）通过ATM磷酸化Beclin1-T57诱导线粒体自噬发生。3. TPT（拓扑替康）诱导的线粒体自噬可激活caspase-8，并促进其与自噬前体复合物结合从而促进细胞死亡