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金黄色葡萄球菌是引起化脓性感染和院内交叉感染的主要致病菌。该细菌对抗生素的耐药和耐受性的出现已经成为全球严重的公共卫生问题。持留菌形成是细菌对抗生素产生耐受和对外界压力抗性增加的重要原因。细菌丢失细胞壁后可形成L-型,L-型细菌对p-内酰胺类抗生素耐受,同时与持留菌形成有关。目前,关于金黄色葡萄球菌持留菌和L-型的形成机制尚不明确,本项目进行了探讨。目的：探讨金黄色葡萄球菌持留菌和L-型形成的分子机制。方法：1.应用氨苄青霉素筛选金黄色葡萄球菌Newman株突变文库,通过反向PCR和核酸测序鉴定获得1株突变株；选用质粒pT181对突变基因NWMN0037进行回补。2.利用氨苄青霉素（10μg/ml）和诺氟沙星（20μg/ml）暴露试验和外界压力（58℃耐受、100mMH2O2、饥饿）试验研究Newman野生株、NWMN0037突变株及回补株不同时期培养物对氨苄青霉素和诺氟沙星的耐受性以及对外界压力抵抗的变化；观察在33℃、37℃C和42℃培养温度下的生长状况。3.应用结晶紫染色、测定OD值及扫描电子显微镜观察Newman野生株、NWMN0037突变株及回补株生物膜形成能力的变化；THP1细胞胞内存活试验观察抗吞噬细胞杀菌能力变化；测定三株菌对BALB/c小鼠LD50；BALB/c小鼠皮下注射试验菌株,计数48小时时病变组织中活菌数,结合病理学观察,研究毒力变化。4.利用Real time RT PCR测定Newman株培养过程中NWMN0037基因表达变化；通过转录组测序分析野生株和NWMN0037突变株在培养6小时和12小时（给予诺氟沙星3小时）时基因组转录水平差异,并通过溶血、甘露醇分解和色素形成试验进行表型验证。分析NWMN0037影响持留菌形成、对外界压力抵抗以及毒力的作用机制。5.制备金黄色葡萄球菌L型诱导培养基（LIM）并进行优化,通过观察“油煎蛋样”菌落、超微结构和革兰染色鉴定细菌L-型。筛选Newman株突变文库；通过反向PCR和核酸测序鉴定L-型缺陷突变株；Real time RT PCR分析8株筛选到的突变基因在L-型形成过程中的表达变化；利用质粒pT181对突变基因glpF进行回补；分析甘油代谢相关基因及其它突变基因在金黄色葡萄球菌L-型形成中的作用。结果：1.经过筛选和鉴定获得1株持留菌形成能力降低的金黄色葡萄球菌NWMN0037突变菌株；应用质粒pT181和NWMN0037基因回补了突变株。2.对数期晚期培养物分别在氨苄青霉素和诺氟沙星中暴露7天时,NWMN0037突变株全部死亡,而野生株和回补株的活菌对数值分别是7.71±0.24和7.35+0.06、7.95+0.16和7.10±0.18。对数期早期及稳定期三株菌培养物对抗菌药物耐受性无差异；突变株对58℃、100mM H2O2和饥饿的抵抗作用及33℃的增殖能力均低于野生株和回补株；在37℃和42℃时增殖能力无差异。3. NWMN0037突变株生物膜形成能力低于野生株和回补株,突变株OD590（0.208±0.053）显著低于野生株（1.025±0.493）和回补株（1.057±0.188）（P<0.05）；突变株被THP1吞噬24小时时细胞内活菌数对数值（3.30±0.03）低于野生株（4.84±0.20）和回补株（4.13±0.04）；LD50（8.33×1010CFU/ml以上）高于野生株（2.41×109CFU/ml）和回补株（1.21×1010CFU/ml）;突变株致化脓和损伤能力较野生株和回补株减弱,48小时时病变组织中活菌计数对数（3.09士0.12）低于野生株（4.51+0.45）和回补株（4.02±0.10）。4. Newman株在TSB中培养5-12小时阶段,NWMN0037表达呈下降趋势。野生株和突变株比较,在培养6小时,有135个基因表达上调,分布在物质转运、物质代谢、与毒力有关、免疫逃逸、调节、应激反应、细胞壁和荚膜合成等方面。另外有466个基因表达水平显著下调,大多数与代谢相关。在12h后即加入诺氟沙星作用3小时后,有42个基因表达上调,分布在物质转运、物质代谢、与毒力有关（细胞毒素相关的基因hla, hlgA, hlgB, hlgC, lukF, lukS和细胞外蛋白酶相关基因NWMN1067, chp, ssp）、免疫逃逸、调节、应激反应、细胞分裂等多个方面。有611个基因表达水平显著下调,大多数与代谢相关。有39个基因在野生株表现为给药后升高,而在突变株未升高,分布在物质代谢、免疫逃逸、调节等方面。突变株的溶血、甘露醇发酵及色素形成能力均低于野生株和回补株。5.金黄色葡萄球菌L-型丢失了细胞壁,多形态,革兰染色阴性,菌落呈“油煎蛋样”；在诱导时,含有20%蔗糖的LIM优于5%和10%；3.5%NaCl优于7%；750-1000unit/ml青霉素优于500和1500unit/ml;稳定期接种物优于对数期；33℃培养优于37℃C和20℃。筛选突变文库获得了15株突变株,其中转座子插入至glpF和NWMN0623中各3株,插入至gntK、NWMN0623、NWMN0872、NWMN1269、NWMN0333和NWMN0843中各1株,另有3株的转座子插入至基因间。除gntK转录水平在Newman株形成L-型时无显著升高外（P>0.05）,其余7个基因在形成L-型时均显著升高（P<0.05）。glpF突变株经过回补后或在含1%甘油的LIM上可获得形成L-型能力。glpF突变株对氨苄青霉素和诺氟沙星耐受性低于野生株和回补株。结论：1.NWMN0037通过下调细菌代谢、促进分泌外毒素和细胞外蛋白酶、影响生物合成、免疫逃逸、调节功能、细胞分裂、生物膜生成和各种应激反应等多种途径影响金黄色葡萄球菌对数期晚期持留菌形成、对外界压力的应激反应、较低温度生长、生物膜形成以及毒力。有望成为控制金黄色葡萄球菌持留菌形成和研制疫苗的候选基因。2.膜蛋白相关转运功能、DNA修复、能量产生、铁离子平衡、生物合成等多个途径参与金黄色葡萄球菌L型形成：甘油代谢在金黄色葡萄球菌L-型和持留菌形成中扮演重要角色。3.含有20%蔗糖、3.5%氯化钠和750-1000Unit/ml青霉素的LIM以及选用稳定期接种物、33℃培养温度是金黄色葡萄球菌L-型诱导培养时的优化条件。