论文部分内容阅读
目的探讨IL-17、Insulin、IGF1、AZD5363对HEC-1-A细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,明确IL-17、Insulin、IGF1、AZD5363是否通过AKT/GSK3β信号通路发挥作用,为子宫内膜癌临床治疗提供理论依据。方法1体外培养子宫内膜癌HEC-1-A细胞株,实验设为9组:空白对照组(Control组,不加任何药物处理)、AZD5363组(2μM AZD5363处理3h)、Insulin组(50ng/m L胰岛素处理2.5h)、IL-17组(20ng/m L IL-17A处理2h)、IGF1组(50ng/m L IGF1处理2.5h)、Insulin+IL-17组(加IL-17A前50ng/m L胰岛素作用30min,其余同IL-17组)、IGF1+IL-17组(加IL-17A前50ng/m L IGF1作用30min,其余同IL-17组)、AZD5363+Insulin+IL-17组(加IL-17A前AZD5363作用1h,胰岛素作用30min,其余同IL-17组)、AZD5363+IGF1+IL-17(加IL-17A前AZD5363作用1h,IGF1作用30min,其余同IL-17组)。2显微镜下观察子宫内膜癌细胞6h、12h、24h、48h的生长状态。3 CCK8法检测IL-17、Insulin、IGF1、AZD5363对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响。4划痕实验检测IL-17、Insulin、IGF1、AZD5363对子宫内膜癌细胞迁移能力的影响。5 Transwell小室观察IL-17、Insulin、IGF1、AZD5363对子宫内膜癌细胞侵袭功能的影响。6Western blot方法检测各组细胞IL-17蛋白表达;检测信号通路P-AKT、PGSK3β、AKT、GSK3β蛋白表达以及IL-17下游基因MMP9、MMP2的蛋白表达。7实时荧光定量PCR技术检测IL-6、CXCL1、TNF-a、CCL2 m RNA水平。结果1细胞增殖能力:Insulin组、IL-17组、IGF1组,Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组细胞处理后0h至24h细胞活力增强,24h达高峰,至24h-48h呈现下降趋势;Insulin组、IL-17组、IGF1组在6h、12h、24h、48h各相同时间点细胞活力均高于Control组;Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组细胞增殖能力高于单独用药组;AZD5363组低于Control组,AZD5363+Insulin+Il-17组、AZD5363+IGF1+IL-17组低于Insulin+IL-17组、IGF1+IL-17组,差异均有统计学意义。2细胞迁移能力:在相同时间点IL-17组、Insulin组、IGF1组细胞痕愈合率高于Control组,AZD5363抑制剂组细胞划痕愈合率明显降低(P<0.05);Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组高于各自单独用药组(P<0.05);AZD5363+Insulin+Il-17组、AZD5363+IGF1+Il-17组低于Insulin+IL-17组和IGF1+IL-17组。3细胞侵袭能力:IL-17组、Insulin组、IGF1组侵袭细胞数量大于Control组,AZD5363组侵袭细胞数量减少(P<0.05);Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组高于各自单独用药组(P<0.05);AZD5363+Insulin+Il-17组、AZD5363+IGF1+Il-17组侵袭细胞数少于Insulin+IL-17组和IGF1+IL-17组(P<0.05)。4蛋白检测结果:1)IL-17蛋白表达:IL-17组、Insulin组、IGF1组高于Control组;Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组高于各自单独用药组(P<0.05);加入AZD5363抑制剂组IL-17蛋白表达明显降低(P<0.05)。2)Akt/GSK3β信号通路蛋白表达:IL-17组、Insulin组、IGF1组P-GSK3β及P-Akt蛋白均高于Control组;Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组高于单独用药组(P<0.05),加入AZD5363抑制剂组蛋白表达均降低(P<0.05)。3)MMP9、MMP2蛋白表达:IL-17组、Insulin组、IGF1组MMP9及MMP2蛋白表达均高于Control组;Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组高于单独用药组(P<0.05);AZD5363组降低MMP9、MMP2蛋白表达(P<0.05)。5基因检测结果:IL-17组、Insulin组、IGF1组的IL-6、TNF-a、Ccl2、CXCL1 m RNA水平均高于Control组;Insulin+Il-17组、IGF1+Il-17组高于单独用药组(P<0.05);加入AZD5363降低IL-6 m RNA、TNF-a m RNA、Ccl2 m RNA、CXCL1 m RNA水平(P<0.05)。结论1 IL-17、Insulin、IGF1促进HEC-1-A细胞的增殖、迁移和侵袭;2Insulin/IGF1通过AKT/GSK3β磷酸化增强IL-17诱导的炎症反应;3 AZD5363可能通过AKT/GSK3β信号通路抑制IL-17与Insulin/IGF1的协同作用。图8幅;表6个;参137篇。