肿瘤抗原是指细胞癌变过程中出现的新抗原及过度表达的抗原物质的总称,不仅能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答,而且还可以应用于肿瘤的免疫学诊断和靶向性免疫治疗。肿瘤/睾丸抗原(cancer/testis antigen, CTA)属肿瘤抗原的一类,迄今为止已命名了46个基因家族共编码91个不同的转录子。在正常组织中仅限制性表达于睾丸,其他正常组织不表达,而在某些肿瘤组织中可有明显的表达,相当一部分CTA在肿瘤患者体内具有免疫原性,可诱导机体产生体液免疫和/或细胞免疫。正是由于这些特点,CTA已成为肿瘤免疫治疗的重要候选分子,为制订肿瘤免疫新的策略提供了新的概念和思考。尽管目前已经有许多CTA被陆续鉴定出来,但可以应用于肿瘤疫苗的构建及靶向治疗的CTA还十分有限。在鉴定CTA的诸多方法中,无论是免疫学方法和还是基因表达分析法均有一定的局限性。因此,急需有更加有效的方法来筛选新的CTA。基于CTA限制性表达于睾丸组织的特点,本文设计了一种新的筛选策略,命名为生精细胞特异性单抗筛选CTA的方法(spermatogenic cells specific monoclonal antibody-defined cancer/testis antigens, SADA),即以人生精细胞免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),免疫组化法筛选出生精细胞特异性mAb,在蛋白水平上研究其在肿瘤组织和其他正常组织的表达分布规律,在此基础上,选择具有CTA表达规律的mAb,通过质谱分析技术鉴定mAb识别的CTA,为肿瘤疫苗的设计及肿瘤的靶向治疗提供新的策略。通过SADA方法,我们筛选出了19种候选分子,在睾丸组织中的染色结果不尽相同,其中5株mAb具有CTA样的表达分布规律。另外,我们还筛选到了一些特异表达于生精过程不同阶段的mAb,如定位于生精过程的早期、中期或晚期,这些抗体所识别的分子可能在精子发生过程中发挥着重要功能,所以,这些抗体的获得也将为生殖科学的研究提供有力的工具。质谱技术是当前研究蛋白质的重要手段,以抗体进行免疫沉淀后再行质谱分析是分离和鉴定蛋白质最常用到的方法。我们先期选择了4株IgG1亚类的抗CTA的mAb进行鉴定,既FM-1、FM-5、FM-6和FM-18。免疫细胞化学结果显示,这4株mAb宫颈癌细胞系Hela细胞上均有表达,所以选择此细胞进行免疫沉淀。FM-1和FM-5均能从细胞裂解液中纯化出目的分子条带,质谱分析结果显示,FM-1识别的分子确定为BAP31,而FM-5尚未能测出结果,推测可能原因是样品绝对量不足或纯度不够,需进一步优化实验条件后再度送检。BAP31分子最初由Kim等人于1994年鉴定,除去在BCR的活化过程中起作用外,BAP31还可作为载体蛋白介导包括MHC-Ⅰ分子在内的多种蛋白从内质网到高尔基体的转运。同时,BAP31还是一种BCL-2/BCL-XL相关蛋白,可作为凋亡调节因子参与细胞凋亡过程的调节。应用免疫组织化学染色的方法,我们首次发现BAP31分子高表达于睾丸组织,阳性产物主要定位于精原细胞和初级精母细胞,说明该分子可能参与了精子发生过程。我们还选择了8种肿瘤组织(宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肝癌、结肠癌、直肠癌和肺癌组织)研究该分子的表达规律,结果显示,在所研究的所有肿瘤组织类型中均见高水平表达,阳性率在58.0%～87.5%之间,阳性产物主要定位于胞浆。由于完整的BAP31分子可以和BCL-2/BCL-XL形成复合物,发挥抗细胞凋亡活性,所以,BAP31的高表达可能会使肿瘤细胞凋亡减少从而参与肿瘤的发生发展,这也需要进一步的实验证实。由于BAP31在除睾丸以外的正常组织中表达水平较低,而在睾丸组织和多种肿瘤组织中高表达,这一分布特点与CTA非常相似。其基因定位于Xq28,与MAGE-A、NY-ESO-1、LAGE-1、SAGE等CTA编码基因毗邻,因此,我们把BAP31定义为CTA家族中的一个新成员。深入研究其功能可能会为肿瘤的免疫治疗或靶向治疗提供新的思路。以RNAi为工具,本文研究了拆除BAP31基因表达后对Hela细胞的增殖、细胞周期、体外侵袭能力及对化疗药物的耐药性的影响。结果显示,BAP31基因表达下调后细胞增殖速度减慢,细胞出现G1期阻滞且侵袭能力明显下降,并且对化疗药物诱导的凋亡的敏感性增加。因BAP31参与众多蛋白的转运过程,这中间可能包括一些与细胞增殖、细胞周期和侵袭相关的蛋白,可能导致功能蛋白在内质网的滞留从而影响细胞的生物学行为。此外,BAP31还可使PTPLB(protein tyrosine phosphatase-like B)免受降解,后者可作为一种磷酸化调节因子,调节细胞内重要蛋白的磷酸化水平,进而使细胞的生物学行为发生改变。CD分子在血细胞的分化、增殖、活化、迁移以及机体防御性免疫应答、炎症、细胞凋亡、自身免疫和器官发生等许多生理和病理过程中发挥重要的作用。随着人类功能基因组计划研究的深入以及免疫学同其他学科的交叉,CD分子的概念逐渐被人类细胞分化分子(human cell differentiation molecule, HCDM)所替代。由于精子发生的过程也是精原细胞分裂、分化直至成熟的过程,所以,某些CD/HCDM分子也可能会参与精子的发生。研究CD分子在睾丸组织中的表达分布情况有助于深入理解精子的发生机制,并有可能在已鉴定的CD分子中发现新的CTA候选分子。应用免疫组织化学染色技术,本文研究了29个CD分子在人睾丸组织中的表达分布规律,结果显示有15个在睾丸组织中有表达,其中CD326表达趋势引起了我们的关注。CD326即上皮细胞黏附分子(Ep-CAM),主要表达于上皮细胞表面,上皮细胞源性肿瘤细胞表达升高。CD326在睾丸组织中表达于精原细胞和少数初级精母细胞,定位于细胞膜,可能在生精细胞间的黏附中起作用。CD326表达趋势类似于广泛表达的CT基因,如IL13Ra/CT19、TSP50/CT20、SPA-17/CT22、OY-TES-1/CT23和PLU-1/CT31等,在大多数非生殖组织中可见表达,睾丸组织和肿瘤组织中高表达,因此,CD326可能成为CTA家族的一个新成员。