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目的:本研究首先从体外探讨乳腺癌微环境中前脂肪细胞和成熟脂肪细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与迁移能力的影响;再从体内、外两个层面,研究BMP9对脂肪微环境中乳腺癌细胞生长和转移的影响及可能机制。方法:诱导前脂肪细胞3T3-L1成为成熟脂肪细胞。将前脂肪细胞和成熟脂肪细胞分别和乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养,实验设空白对照组(MDA-MB-231细胞)、前脂肪细胞共培养组(MDA-MB-231细胞+3T3-L1前脂肪细胞)和成熟脂肪细胞共培养组(MDA-MB-231细胞+成熟脂肪细胞)。通过显微镜成像、油红O染色实验、MTT实验、Transwell实验和划痕实验分别观察肿瘤细胞形态、增殖及迁移能力的改变。Western blot法和ELISA法检测前脂肪细胞与成熟脂肪细胞中瘦素的表达水平;细胞免疫荧光法和Western blot法分别检测肿瘤细胞中瘦素受体Ob-R、瘦素信号通路关键分子以及下游靶因子的表达水平变化。再加入瘦素中和抗体处理后,采用Western blot法检测肿瘤细胞瘦素信号通路的变化。将BMP9表达腺病毒(Ad BMP9)、BMP9干扰腺病毒(AdsiBMP9)分别感染乳腺癌mda-mb-231细胞,构建高表达bmp9的乳腺癌细胞(mda-mb-231/adbmp9),及低表达bmp9的乳腺癌细胞(mda-mb-231/adsibmp9)。利用transwell小室共培养技术,将成熟脂肪细胞分别与mda-mb-231细胞(co-blankgroup)、表达腺病毒载体对照mda-mb-231/adgfp细胞(co-gfpgroup)、干扰腺病毒载体对照mda-mb-231/adrfp细胞(co-rfpgroup)、mda-mb-231/adbmp9细胞(co-bmp9group)、mda-mb-231/adsibmp9细胞(co-sibmp9group)进行共培养。针对共培养体系中的肿瘤细胞:mtt实验检测增殖能力的变化,流式细胞术检测细胞周期变化,划痕实验和transwell实验检测细胞迁移能力的改变,westernblot检测瘦素、瘦素信号通路关键因子及下游增殖相关cyclind1、c-myc和转移相关mmp9蛋白的变化;westernblot和elisa检测共培养体系中脂肪细胞的瘦素表达水平。将乳腺癌细胞与脂肪细胞以1:5的比例混合后,注射到裸鼠皮下,监测瘤体的生长并绘制生长曲线;取离体肿瘤组织进行he和免疫组化染色,检测瘤体中瘦素信号通路关键因子的表达情况。结果:(1)显微镜下可以观察到诱导后的前脂肪细胞出现明显脂滴,油红o染色阳性,证明成熟脂肪细胞诱导成功。(1)相比于单独培养的肿瘤细胞,与前脂肪细胞或成熟脂肪细胞共培养的肿瘤细胞具有下述改变:肿瘤细胞形态变得更加纤长,其增殖能力增强(p<0.05),穿过小室的肿瘤细胞数明显增多(p<0.05),划痕愈合率也明显增加(p<0.05),且成熟脂肪细胞的促进作用更加明显(p<0.05)。成熟脂肪细胞共培养组的肿瘤细胞中还出现了明显的脂质累积。(2)可能的机制探讨:westernblot法和elisa法检测发现,前脂肪细胞和成熟脂肪细胞均有瘦素的表达,且成熟脂肪细胞瘦素的表达量明显高于前脂肪细胞(p<0.05)。相较于空白对照组,两个共培养组肿瘤细胞p-akt、p-stat3、cyclind1和mmp9的蛋白质水平均明显上调(p<0.05),且成熟脂肪细胞共培养组上升水平要明显高于前脂肪细胞共培养组(p<0.05),而p-erk1/2只在前脂肪细胞共培养组中有所上调(p<0.001),在成熟脂肪细胞共培养组中并没有明显变化。和共培养组相比,瘦素中和抗体处理后可以抑制肿瘤细胞中瘦素下游信号通路的激活。rt-pcr及westernblot检测各组肿瘤细胞bmp9的表达情况,证实bmp9过表达和干扰均成功。分组共培养后:(2)外源性高表达bmp9:可以抑制共培养体系中肿瘤细胞的增殖(p<0.05),使其周期阻滞在g1期(p<0.05),并降低cyclind1和c-myc的蛋白水平(p<0.05);可以降低肿瘤细胞划痕愈合率和穿膜细胞数,抑制肿瘤细胞迁移能力(p<0.05),降低mmp9的蛋白表达量。westernblot结果显示,共培养体系中肿瘤细胞瘦素和瘦素受体表达没有受到太大的影响(p>0.05),但可以降低脂肪细胞瘦素的表达(p<0.05);elisa法检测培养基中脂肪细胞分泌的瘦素水平同样下降(p<0.05)。westernblot检测肿瘤细胞中瘦素下游信号通路发现,akt和stat3的磷酸化水平有所降低(p<0.05)。动物移植瘤实验发现,co-bmp9组的瘤体明显小于co-gfp对照组(p<0.05);瘤体he染色发现,co-bmp9组细胞排列疏松,核较小,分化较对照组好;免疫组化结果显示,Co-BMP9组leptin及leptin下游p-STAT3、p-Akt、cyclin D1、c-myc和MMP9的表达均明显下调。(3)干扰内源性BMP9的表达后:脂肪微环境中的肿瘤细胞增殖能力明显高于对照组(P<0.05),S期细胞增多(P<0.01),cyclin D1和c-myc的蛋白水平升高(P<0.05);划痕实验和Transwell实验结果均显示,肿瘤细胞迁移能力增强(P<0.05)。Western blot和ELISA结果显示,脂肪细胞瘦素的表达和分泌增加;western blot检测肿瘤细胞中瘦素下游信号通路发现,Akt和STAT3的磷酸化水平高于对照组(P<0.05)。动物移植瘤实验发现,Co-siBMP9组瘤体明显大于Co-RFP对照组(P<0.05);HE染色观察到,Co-siBMP9组细胞排列紧密且非常紊乱,核大深染;免疫组化结果显示,Co-siBMP9组leptin及leptin下游p-STAT3、p-Akt、cyclin D1、c-myc和MMP9的表达均增强。结论:1.前脂肪细胞和成熟脂肪细胞都能促进乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移,成熟脂肪细胞促进作用更加明显,且这一促进作用与瘦素信号通路有关;2.BMP9可以通过调节乳腺癌微环境中脂肪细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞的相互作用,在体内外抑制乳腺癌细胞生长和转移,BMP9的这一作用可能是通过降低脂肪细胞的瘦素表达,从而减少瘦素对乳腺癌细胞生长、转移的促进作用来实现的。