【摘 要】
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由胸膜肺炎放线杆菌（App）引起的猪传染性胸膜肺炎和由多杀性巴氏杆菌（Pm）引起的猪萎缩性鼻炎及猪肺疫是常见的猪呼吸系统疾病,上述两种疾病常呈混合感染,各年龄段猪群均易感,可通过气溶胶及接触传播,常呈全群性爆发,给养猪业带来了极大的损失。本研究利用传染性胸膜肺炎放线杆菌的外毒素蛋白ApxⅣ和多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白H（OmpH）制备可以同时防控以上两种疾病的二联基因疫苗,为胸膜肺炎放线杆菌和多杀性
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由胸膜肺炎放线杆菌（App）引起的猪传染性胸膜肺炎和由多杀性巴氏杆菌（Pm）引起的猪萎缩性鼻炎及猪肺疫是常见的猪呼吸系统疾病,上述两种疾病常呈混合感染,各年龄段猪群均易感,可通过气溶胶及接触传播,常呈全群性爆发,给养猪业带来了极大的损失。本研究利用传染性胸膜肺炎放线杆菌的外毒素蛋白ApxⅣ和多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白H（OmpH）制备可以同时防控以上两种疾病的二联基因疫苗,为胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌疫苗的研究提供理论基础。本研究通过在线生物软件对APP的外毒素ApxⅣ与Pm的外膜蛋白H（OmpH）基因进行T细胞和B细胞表位筛选;将筛选的优势抗原表位序列通过连接肽连接后,构建新的肽段（命名为New）,并利用在线生物信息软件对其进行分析;分别将ApxⅣ、OmpH和New基因序列通过同源重组的方法构建至真核表达载体GV658,通过双酶切验证目的基因的大小;将新构建的3种重组粒转染HEK293细胞,CCK-8实验评估其对细胞的安全性;RT-PCR和western blotting验证外源基因蛋白的转录和表达情况;免疫荧光（IFA）验证重组质粒中外源基因蛋白在细胞中的免疫定位。试验结果显示,New肽段具有较好的免疫源性,所构建的重组质粒GV658-ApxⅣ、GV658-OmpH、GV658-New双酶切结果与目的基因大小相符,可转染HEK293细胞并成功表达,且对HEK293细胞无明显损伤作用。将构建的3种重组质粒等比混合,制备APP与Pm二联基因疫苗,同时制备GV658-ApxⅣ、GV-658-OmpH、GV658-New 3 种质粒疫苗及 APP 菌影疫苗,PBS 为对照组,每2周对SD大鼠进行免疫,连续免疫3次。最后一次免疫结束后2周采取外周血并解剖摘取内脏进行分析。流式细胞术结果显示,二联疫苗组（Mix）CD3+细胞、CD4+/CD8+细胞比例升高,显著高于PBS组（P<0.05）;血清抗体结果显示,Mix（二联疫苗）组的APP与Pm的抗体滴度显著高于PBS组（P<0.05）,较APP菌影、ApxⅣ、OmpH和New组抗体滴度结果差异不显著（P>0.05）;脏器病理组织切片和脏器体重比结果显示,各组实验组与对照组一样,组织切片与脏器体重比结果均正常;肝脏组织切片免疫荧光（IFA）结果显示,除对照组外各实验组在肝脏组织中均可见明显的荧光染色。综上所述,本课题构建的重组二联基因疫苗,产生的抗体滴度与APP菌影、ApxⅣ、OmpH、New单苗结果一致并对动物机体未造成明显的损伤,安全性较好,可同时对APP和Pm 2种疾病产生免疫保护。籍此,为APP与Pm疫苗的研究提供理论依据和研究基础。
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