LPEMFs抑制氧化应激修复大鼠脊髓损伤的实验研究

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【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是脊柱外科最严重的创伤性疾病之一,具有高发病率、高致残性、低死亡率、修复困难的特点。本研究旨在通过体外SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤模型和体内大鼠脊髓挫伤模型的实验研究,明确低频脉冲电磁场(Low-Frequency Pulsed Electromagnetic Fields,LPEMFs)对脊髓损伤大鼠局部抗氧化应激的修复作用及最佳刺激参数,并验证其抗氧化应激机制是否与PI3K/Akt/HSP70信号通路相关,为脊髓损伤的早期干预提供一种无创的替代治疗方法。【方法】1.细胞存活和活性氧生成实验:使用不同浓度H2O2体外构建SH-SY5Y细胞的氧化应激损伤模型,选取半抑制浓度(IC50)构建标准模型,选取不同磁场强度(0.5m T-3m T)、不同作用时长(0.5h-2.5h/d)LPEMFs干预,观测细胞形态变化,通过CCK8法检测细胞活性,筛选最佳LPEMFs刺激参数(50Hz,2.5m T,1h/d),使用荧光活性氧检测试剂盒(ROS assay kit)检测SH-SY5Y细胞中活性氧生成情况;2.脊髓损伤模型制备:使用Impactor Model-III打击仪制作大鼠T10脊髓挫裂伤模型,选取最优磁场强度、作用时长的LPEMFs对脊髓损伤大鼠进行干预,连续2周对实验动物行BBB评分,研究LPEMFs对大鼠行为学变化影响;伤后2周使用电生理仪对大鼠体感诱发电位(Somatosensory Evoked Potential,SEP)、运动诱发电位(Motor Evoked Potential,MEP)监测,研究LPEMFs对大鼠神经电生理变化的影响;3.免疫炎症因子表达测定:伤后2周取大鼠脊髓组织,使用酶联免疫吸附实验方法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)测定免疫因子TNF?α和IL?1β在组织中表达情况;使用免疫组织化学的方法评估脊髓组织切片中NF?κB的表达情况;4.氧化应激反应测定:使用Western Blot方法测定损伤脊髓组织中i NOS的表达情况;使用酶联免疫吸附实验方法测定抗氧化应激因子SOD和CAT在脊髓组织中的表达;使用荧光活性氧检测试剂盒(ROS assay kit)检测脊髓组织中活性氧生成情况;使用免疫组织化学的方法评估脊髓组织切片中抗氧化应激蛋白HSP70的表达情况;5.PI3K/Akt信号通路检测:使用Western Blot方法测定SH-SY5Y细胞中磷酸化和非磷酸化Akt以及HSP70表达变化;使用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002干预后测定PI3K/Akt信号通路激活状态变化以及HSP70表达变化;6.统计学分析:使用Graph Pad Prism 8进行统计分析,结果以均数±标准差(Mean±SD)形式表示,统计方法采用单因素方差分析(One-way ANOVA),事后采用Student-Newman-Keuls法分析组间差异,P<0.05表示差异具有统计学意义。【结果】1.随着过氧化氢浓度增高,SH-SY5Y细胞死亡逐渐增加,存活减少,发现IC50浓度约为50μM,使用该浓度构建标准模型;筛选出最佳LPEMFs刺激参数(50Hz,2.5m T,1h/d)细胞存活率(77.80±6.22%)显著高于单纯氧化应激组(54.60±7.37%)(P<0.05);使用最优LPEMFs干预后能够一定程度减少SH-SY5Y细胞中ROS的产生(5.87±0.62:2.53±0.96)(P<0.05);2.选取最佳刺激参数LPEMFs(50Hz,2.5m T,1h/d)对中度脊髓挫伤模型大鼠进行干预。各组实验动物BBB评分损伤前均为21分,损伤后均为0分。脊髓损伤后大鼠展现出运动功能恢复,单纯脊髓损伤组和LPEMFs干预组在损伤后前7天BBB评分无明显差异,7天后LPEMFs干预组较单纯脊髓损伤组显示出更好的运动功能恢复(P<0.05)。LPEMFs干预后大鼠MEP和SEP波幅均较SCI组明显升高(P<0.05),而LPEMFs组MEP和SEP潜伏期则较空白对照组和假手术组差异无统计学意义;3.脊髓损伤后2周炎症因子TNF?α和IL?1β在脊髓组织中表达升高,LPEMFs干预后能够显著降低损伤脊髓内TNF?α和IL?1β的表达(P<0.05);LPEMFs干预后能够显著减少损伤部位脊髓前角的NF?κB的表达(P<0.05);4.LPEMFs干预后显著降低损伤脊髓内i NOS和ROS的表达(P<0.05),并显著增加损伤脊髓内SOD、CAT和HSP70的表达(P<0.05);5.LPEMFs干预后激活SH-SY5Y细胞PI3K/Akt信号通路,增加体外SH-SY5Y细胞HSP70表达(P<0.05);使用抑制剂干预能够抑制SH-SY5Y细胞PI3K/Akt信号通路,减少体外SH-SY5Y细胞HSP70表达并能拮抗LPEMFs的抗氧化应激作用。【结论】1.LPEMFs可以在体外抑制SH-SY5Y细胞氧化应激损伤,发现LPEMFs抗氧化应激作用最佳刺激参数为(50Hz,2.5m T,1h/d),为体内实验提供依据;2.LPEMFs可以改善脊髓损伤大鼠运动功能,并增加SEP和MEP的波幅;LPEMFs可以改善脊髓损伤大鼠局部微环境,降低炎症反应,并通过上调抗氧化酶CAT和SOD而减轻氧化应激,其潜在机制与HSP70高表达相关;3.LPEMFs抑制氧化应激损伤的机制与激活PI3K/Akt/HSP70信号通路密切相关。
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